粪便和血液中的新型DNA甲基化生物标志物用于早期结直肠癌和进展期...

作者：医世象


结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。随着中国经济增长和饮食西化，近十年来结直肠癌的发病率和死亡率逐渐上升。大多数结直肠癌病例起源于肿瘤性前体病变，持续时间为10-15年。远期结直肠癌患者的5年生存率为14%，而早期结直肠癌患者的预后较好。结肠镜检查被认为是预防结直肠癌的金标准。但是其昂贵和侵入性的特征，以及需要肠道准备导致了患者依从性差。同时还存在着出血穿孔、漏诊等缺陷。粪便潜血试验灵敏度和特异性高，但受药物和饮食的影响很大。

许多研究表明，检测循环肿瘤DNA（ctDNA）中的DNA突变和异常甲基化可以为早期结直肠癌筛查提供新的方法。DNA甲基化可以通过改变基因表达来影响肿瘤发生。肿瘤特异性DNA甲基化出现在肿瘤发展的早期。对于结直肠癌的早期诊断，检测血液和粪便中肿瘤DNA异常甲基化的方法提出了一种新的方法。

美国食品药品监督管理局（FDA）已批准一种基于血液的结直肠癌筛查方法，该方法通过检测血浆中的生物标志物Septin9甲基化，早期结直肠癌敏感性和特异性分别为59%和79%。

美国食品药品监督管理局（FDA）已批准Cologuard产品，这是第一种基于粪便的结直肠癌筛查方法，包括血红蛋白检测、KRAS基因突变以及NDRG4和BMP3甲基化。

目前NMPA批准的结直肠肿瘤甲基化检测试剂盒

目前，许多结直肠癌甲基化生物标志物已在各种研究中报道。近日，一篇探索新型DNA甲基化生物标志物用于结直肠癌和进展期腺癌早期筛查的文章发表，文章标题为：Novel DNA methylation biomarkers in stool and blood for early detection of colorectal cancer and precancerous lesions，研究者开发了用于结直肠癌早期筛查生物标志物的新候选CpG位点，并评估了其在血液和粪便样本中筛查结直肠癌和进展期腺癌的诊断价值。



癌症基因组图谱（TCGA）中候选CpG的甲基化状态

为了确保诊断性能和简单性，选择了两个候选CpG位点。cg13096260来自SDC2启动子区，cg12993163来自SHOX2基因体区。两个候选CpG位点在结直肠癌组织中的甲基化水平显著高于正常组织（P<2.0）。cg13096260与SDC2的转录表达呈负相关（P<0.001），而cg12993163与SHOX2的转录表达无显著相关性（P>0.05）。结直肠癌组织中两个CpG位点的甲基化水平呈显著正相关（P < 0.001）。然而，SDC2在正常组织中的表达显著升高（P<0.05），SHOX2在肿瘤组织中的表达显著升高（P<0.01）。此外，生存分析表明，两个CpG位点的甲基化水平低的预后越好（P<0.05）。


CpG候选位点筛选流程图

结直肠癌组织中甲基化生物标志物的生物学验证

癌组织中cg13096260和cg12993163的甲基化水平明显高于正常组织(P<0.001)。93.4%(71/76)肿瘤组织中cg13096260的甲基化水平高于配对正常组织，90.8%(69/76)肿瘤组织中cg12993163的甲基化水平高于配对正常组织，与数据库分析得到的结果一致。

此外，还分析了两个候选CpG位点的甲基化水平与组织样本临床病理特征的关系。不同组织学类型间cg12993163的甲基化水平存在差异(P<0.05)，而其他部分差异不显著。


cg13096260和cg12993163的甲基化水平
甲基化生物标志物测定对粪便样品的性能

在162份结直肠癌、46份进展期腺癌和120份健康人粪便样本中检测了cg13096260和cg12993163的甲基化水平。健康人组cg13096260的甲基化水平明显低于进展期腺癌组和结直肠癌组(P<0.001)，进展期腺癌组的甲基化水平明显低于结直肠癌组(P<0.001)。早期和晚期结直肠癌组之间无明显差异(P>0.05)。健康人组中cg12993163的甲基化水平明显低于进展期腺癌组和结直肠癌组(P<0.001)，而进展期腺癌组和结直肠癌组之间的甲基化水平无显著差异(P>0.05)。

为了在粪便样本中构建组合诊断模型并验证两个候选CpG位点的诊断价值，研究者将328个粪便样本随机分为训练集和验证集，比例为2：1。在验证集中，两个候选CpG位点对疾病具有很高的判别力。cg13096260、cg12993163和结直肠癌模型的灵敏度分别为91.35%、89.5%和93.83%。早期结直肠癌的敏感性分别为93.62%、92.55%和96.81%。进展期腺癌的敏感性分别为63.04%、82.6%和71.74%。特异性分别为93.33%、85.83%和92.5%。



粪便样本的诊断性能：cg13096260 (a)、cg12993163 (b)和联合诊断模型(c)对粪便样本训练集、验证集和总样本的敏感性和特异性
为了进一步研究粪便样本中DNA甲基化检测的特异性，本研究纳入了20名患有其他无结直肠肿瘤的干扰性疾病患者的粪便样本，并测试了候选CpG位点的甲基化水平。

cg13096260在其他消化道肿瘤和结肠炎中的阴性率分别为81.81%（9/11）和100%（9/9），总体阴性率为90%。

cg12993163在其他消化道肿瘤和结肠炎中的阴性率分别为72.73%（8/11）和88.89%（8/9），总体阴性率为80%。

其他消化道肿瘤和结肠炎联合诊断模型阴性率分别为81.81%（9/11）和100%（9/9），总体阴性率为90%。

对血液样本进行甲基化标志物测定

在128个血液样本中检测到两个候选CpG位点的甲基化，包括64个结直肠癌，17个进展期腺癌和47个健康人样品。健康人组cg13096260的甲基化水平显著低于进展期腺癌组（P<0.05）、I期和II期结直肠癌（P<0.01）以及III期和IV期结直肠癌（P<0.001）组，而进展期腺癌组和结直肠癌组（P>0.05）差异无统计学意义。

同样，cg12993163在健康人组中的甲基化水平显著低于进展期腺癌组和结直肠癌组，而AA组和结直肠癌组的甲基化水平差异不显著。


血液样本cg13096260和cg12993163的ROC曲线和AUC

血液样本中两个候选CpG位点对结直肠肿瘤的诊断性能相似。cg13096260和cg12993163对结直肠癌的敏感性分别为75%和81.25%；早期结直肠癌分别为67.57%和81.08%；AA分别为70.59%和76.47%。特异性分别为82.98%和74.47%。研究包括了八名患有其他干扰性疾病但没有结直肠肿瘤的患者的血液样本测试了候选CpG位点的甲基化水平。cg13096260在胃恶性肿瘤和结肠炎中的阴性率为75%（3/4），总体阴性率为75%。cg12993163在胃恶性肿瘤和结肠炎中的阴性率分别为50%（2/4）和75%（3/4），总体阴性率为62.5%。

在本研究中，研究者开发了两种用于CRC和进展期腺癌的候选CpG位点：cg13096260和cg12993163。并且验证了在粪便样本中，这两个甲基化位点单独或组合检测不同阶段的结直肠癌和AA具有极好的诊断价值。因此，在粪便样本中检测cg13096260和cg12993163可能是筛查和早期诊断CRC和进展期腺癌的一种有效的方法。
参考文献：https://doi.org/10.1186/s13148-023-01443-7作者：甲基化 叶子，转载请联系授权。推荐阅读：
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