编译：刘溪； 审校：张军，缪长虹
肿瘤转移是威胁乳腺肿瘤患者生命的一个重要原因。应激状态下，交感神经兴奋释放的神经递质可作用于肿瘤细胞或者肿瘤相关性免疫细胞的β-受体，促进肿瘤转移。手术治疗前，患者的精神压力和生理应激均会促进自身交感神经兴奋，激活β-肾上腺素能受体信号通路，从而可能增加肿瘤转移的概率。那么，β-肾上腺素能受体阻滞剂（β-受体阻滞剂）是否能通过阻断这一通路来降低肿瘤转移的发生呢？2019年Hiller JG等人在《Clin Cancer Res》杂志上发表了一篇题为《Preoperative β-Blockade with Propranolol Reduces Biomarkers of Metastasis in Breast Cancer: A Phase II Randomized Trial.》的II期临床随机对照研究，观察了非选择性β-受体阻滞剂普萘洛尔对乳腺肿瘤转移风险的影响。现介绍如下：
试验方法1.试验设计该试验是一项由澳大利亚墨尔本Peter MacCallum癌症中心开展的单中心、三盲、安慰剂对照临床研究。收集了从2016年1月至2017年9月间的乳腺肿瘤患者。纳入标准包括：① 可使用英文交流的女性患者；② 年龄18-80岁；③ 诊断为可进行手术切除的原发性乳腺肿瘤。排除标准包括：① 处于哺乳、妊娠期的患者；② 6个月内曾进行过乳腺肿瘤手术治疗的患者；③ 接受过新辅助化疗或激素治疗的患者；④ 病理诊断为孤立性原位导管肿瘤的患者；⑤ 对普萘洛尔有禁忌症的患者；⑥ 有中重度哮喘或脑卒中病史的患者；⑦ 三个月内规律服用以下药物者：β-受体阻滞剂，抗焦虑药，非甾体类抗炎药（每日服用），α-肾上腺素能受体激动剂，钙离子通道阻滞剂。共计纳入64名受试者，随机分入两组：术前一周应用安慰剂治疗组（安慰剂组）和术前一周应用普萘洛尔治疗组（普萘洛尔组）。参与该项研究的受试者，治疗医师和试验结果观察者均不了解受试者分组。2.给药方案和麻醉管理受试者于术前一周每日口服普萘洛尔或者安慰剂，40 mg每次，每日两次。3日后，若受试者舒张压大于110 mmHg，且心率大于65次/分钟，且无其他显著并发症（如晕厥、疲劳或失眠等），则增加药物（普萘洛尔或安慰剂）剂量至每次80 mg，每日两次，直至手术当日早晨（见图1A）。所有受试者麻醉方案均依据指南进行，记录术中血流动力学数据。手术当日，使用Likert量表对受试者焦虑程度进行评估：询问受试者与用药前相比感到焦虑或压力的程度是“更好”、“无差别”或者“更糟”。图1. 试验计划和CONSORT流程图3.基因表达分析和免疫组化观察炎症标志物和普萘洛尔水平。从病理诊断标本和手术切除的肿瘤标本中提取RNA。检测RNA的质量和完整性，通过逆转录得到DNA进行测序。在肿瘤切片上通过免疫组化测定普萘洛尔对原发性肿瘤免疫状态的影响。免疫染色程度评分为：0“无反应””；1“稀疏”；2“轻度”；3“致密”；4“非常致密”。采用低强度（1-2）或高强度（2-4）的二分法分析免疫细胞浸润程度。结果1.人口统计学资料和试验终止情况在乳腺肿瘤患者术前服用普萘洛尔或安慰剂的随机对照三盲Ⅱ期临床研究中，64名受试者被招募、登记并随机分配到不同治疗组（见图1B）。每组均有4名受试者终止试验：3名受试者在开始药物治疗前由于健康状况变化而自行退出，1名受试者由于手术日期紧迫无法按照方案给药而终止。两组之间的人口统计学数据和肿瘤病理分期分级无明显统计学意义（见表1）。表1. 人口统计学资料2.受试者依从性和药物管理术前15次给药的依从性达96%；两名受试者在手术当日早晨没有服药。15名受试者（50%）因以下原因每天两次给药不超过40 mg：未达到血压标准（普萘洛尔组12例，安慰剂组0例）；未达到心率标准（普萘洛尔组1例，安慰剂组1例）；疲劳（普萘洛尔组1例，安慰剂组1例）；失眠（普萘洛尔组1例，安慰剂组0例）。普萘洛尔组受试者在手术当日的血药浓度随当日晨服的普萘洛尔剂量而变化：0 mg（n=2，中位数7.5 ng/ml，四分位间距5.8-9.1），40 mg（n=13，中位数18.0 ng/ml，四分位间距11.2-32.1），和80 mg（n=15，中位数65.6 ng/ml，四分位间距54.6-110.0）。3.临床效能和安全性受试者对研究药物均耐受良好。每组有1例受试者出现无症状性心动过缓（心率<50 次/min），普萘洛尔组3例受试者出现无症状性低血压（收缩压<100 mmHg），无支气管痉挛发作。普萘洛尔降低术前心率、收缩压、术中心率，但不降低术中收缩压。手术当日早晨，与安慰剂组相比，普萘洛尔组受试者焦虑情绪降低，具有统计学差异（P<0.025），但受试者压力感觉无显著性降低（P<0.066）（见图2）。图2. 普萘洛尔对术前心率、收缩压和焦虑的影响4.肿瘤基因表达与安慰剂组相比，普萘洛尔组受试者的原发性肿瘤组织中有1054个基因上调了1.25倍，相应的 59个基因下调了1.25倍。普萘洛尔可减少间叶组织分化。普萘洛尔组和安慰剂组肿瘤组织中下调的基因主要来源于间叶组织（0.34±0.12，P=0.002）（见图3A）。普萘洛尔组上调的基因倾向于上皮细胞起源，但无统计学意义（0.07±0.09，P=0.21）。普萘洛尔降低肿瘤内与EMT相关的炎症信号因子。研究者们根据上调和下调基因启动子中转录因子结合基序普遍的不对称性，对已知调控EMT的基因调控途径进行额外的生物信息学分析。首先检验了两个假设：（1）普萘洛尔是否可以下调EMT驱动Snail/Slug和Smad转录因子。结果表明，普萘洛尔治疗组受试者肿瘤组织中Snail/Slug转录因子活性显著降低（上调基因启动子与下调基因启动子的log2对数比为-0.43±0.19，P=0.03；见图3B），Smad转录因子活性有降低趋势（0.19±0.13，P=0.11）。（2）炎症相关NF-κB/Rel和AP-1转录因子活性是否下调，发现普萘洛尔可下调两者（NF-κB/Rel:-1.06±0.41，P=0.01；AP-1:-0.80±0.19，P<0.01；见图3B）。儿茶酚胺信号通过β-肾上腺素能受体激活CREB转录因子识别的cAMP反应元件（CRE）以调节基因表达。因此，检测普萘洛尔对CREB信号通路的潜在影响，可发现其在原发性肿瘤内的活性显著降低（0.48±0.23，P=0.04）。普萘洛尔可增加乳腺肿瘤受试者免疫细胞聚集。该研究还发现普萘洛尔可以下调肿瘤内具有嗜中性粒细胞特征的基因（-2.54±0.48，P<0.0001），以及少部分NK细胞（-0.55±0.13，P<0.0001）；而来源于经典髓系的DC1/BDCA1+树突状细胞（0.17±0.04，P<0.0001）和DC2/BDCA2+浆细胞样树突状细胞（0.18±0.08，P=0.02）基因均上调，这两种细胞都是重要的抗原递呈细胞（见图3C）。在以M1和M2巨噬细胞分布为参考（GSE5099）的其他分析中，接受普萘洛尔治疗的受试者肿瘤内M1巨噬细胞分化增强（0.27±0.12，P=0.01）（见图3D）。图3. 普萘洛尔对上皮间充质转换和免疫状态的影响5.β-受体阻滞剂的临床效能和免疫浸润研究发现一些受试者尽管术前应用普萘洛尔剂量增加，但仍未达到β-受体阻滞剂的临床症状。这些受试者在普萘洛尔开始给药（基线）和手术日（治疗7天后）之间的血压（小于20 mmHg）和心率（小于10 bpm）降低较少（见图4A）。但普萘洛尔组（n=15）和安慰剂组（n=15）受试者肿瘤内免疫细胞反应存在差异（见图4B）。普萘洛尔可以调节整个族群中白细胞基因的表达（见图3C），普萘洛尔组受试者具有持续增高的CD68+巨噬细胞（n=15/15）和CD8+T细胞浸润（n=15/15），而安慰剂组受试者的免疫细胞浸润则减少：CD68+（9/15，P<0.02，Fisher精确检验）和CD8+（10/15，P<0.04，Fisher精确检验）（见图4C）。图4. 临床β-受体阻滞剂对肿瘤免疫浸润的影响讨论该研究提供了第一个前瞻性的临床证据，证明了小鼠肿瘤模型中β-受体阻滞剂的细胞和分子机制可能影响肿瘤的进展过程。在临床前肿瘤模型中，普萘洛尔可以预防EMT，抑制侵袭性伪足形成，减少肿瘤细胞的侵袭和转移，增强抗肿瘤免疫。该研究证明：单药普萘洛尔足以诱导乳腺肿瘤患者肿瘤微环境发生类似的保护性改变，为越来越多的流行病学证据确定了可能的机制，即用于其它适应症的β-受体阻滞剂可改善乳腺肿瘤患者的预后。研究结果强调了β-受体阻滞剂对于肿瘤免疫状态和侵袭性的影响，而这些影响以往是在联合应用非选择性抗炎药和非选择性β-受体阻滞剂普萘洛尔时观察到的。小鼠肿瘤模型和回顾性临床队列研究表明β-受体阻滞剂能防止不同类型肿瘤的进展，这也提示了本研究的发现或许可广泛应用于其它肿瘤类型。另一项前瞻性非盲队列研究报告则表明普萘洛尔（与不用该药相比）降低了黑色素瘤复发率（HR:0.18，95%CI，0.04-0.89；P=0.03）。对普萘洛尔组受试者手术切除的乳腺肿瘤标本进行转录分析发现：EMT极化降低，EMT相关的Snail/Slug转录因子家族活性降低，促炎性NF-κB和AP-1转录因子家族活性降低。与这些发现相一致的是，细胞基础的生物信息学分析发现普萘洛尔或许参与减少中性粒细胞浸润/活化、增加M1巨噬细胞极化、增加BDCA1+典型髓样树突状细胞和BDCA2+浆细胞样树突状细胞的聚集/活化，提示其可能促进肿瘤微环境从炎症反应向支持抗癌免疫的成熟髓细胞群转变。总的来说，EMT、炎症介质和免疫细胞动力学的这种变化与增强细胞免疫反应和降低恶性潜能大体一致。因此，这些生物标记物的发现为将来大规模、检验效能充分的临床队列研究评估β-受体阻滞剂对临床肿瘤治疗结果（如无病生存率和总生存率）的影响提供了强有力的生物学基础。目前还没有针对乳腺肿瘤患者术前应用β-受体阻滞剂的前瞻性临床试验。这项研究结果可以帮助确定未来临床研究的设计思路，即使不考虑个体化用量（80-160 mg/天），低剂量的普萘洛尔足以减少围手术期焦虑和压力，并调节影响肿瘤进展的相关基因表达，对侵袭性肿瘤标志物和炎症因子有良好的调控。此外，研究结果表明，临床终点，如心率和血压的变化，可以作为分子水平测量的无创替代。相反，手术当天的血清普萘洛尔水平与预后无关。在未来的研究中，重要的是确定当药物暴露持续超过一周时，普萘洛尔是否会导致肿瘤基因表达的变化（此处观察到的变化与临床β-受体阻滞剂水平无关（图3）），是否导致同样的免疫细胞聚集变化。而且，确定β-受体阻滞剂导致的细胞免疫募集是否可以改善肿瘤患者长期预后，例如，通过使用标准免疫疗法或化疗提高治疗效果。“论肿道麻”点评
手术切除是治疗早期乳腺肿瘤的重要手段之一。然而，围手术期交感神经系统兴奋以及β-肾上腺素能受体信号通路激活可能增加残余肿瘤侵袭潜能或促进肿瘤微转移，从而导致乳腺肿瘤复发。药理流行病学研究表明，服用β-受体阻滞剂的人群健康比率更高或者乳腺肿瘤患者总体生存率更高。动物实验可能为这一机制作出解释：研究人员在小鼠肿瘤动物模型上发现，β-受体阻滞剂普萘洛尔可以缓解肿瘤病理过程中的炎症免疫抑制，阻止乳腺肿瘤侵袭和转移。而该项前瞻性随机安慰剂对照II期临床试验恰恰表明，术前应用β-受体阻滞剂干预围术期交感系统以及β-肾上腺素能受体信号通路或许可以通过改变多种生物学过程降低乳腺肿瘤术后复发和转移。该研究是首个前瞻性、三盲、随机对照临床试验，研究了术前单一应用非选择性β-受体阻滞剂普萘洛尔对乳腺肿瘤基因表达的影响。试验结果表明术前应用普萘洛尔可下调乳腺肿瘤侵袭潜能和炎性标志物，改善细胞免疫反应。受试者对普萘洛尔耐受良好，说明其安全性高，而且具有良好的抗焦虑作用。虽然乳腺肿瘤手术治疗前应用普萘洛尔以降低肿瘤复发概率，但仍需要更多的临床研究进行证实，而本研究结果提示β-受体阻滞剂或许可以作为控制乳腺肿瘤患者术后复发的辅助疗法。今后仍需要更大样本量的研究以确定普萘洛尔是否具有与肿瘤亚型或患者个体相关的差异效应。由于该研究样本量不大，无法根据受试者人口学特征或肿瘤病理学状态（如ER/PR/Her2状态、肿瘤分级等）对普萘洛尔与肿瘤生理病理过程的关系进行分层研究。同时有证据表明33%的多发性骨髓瘤患者应用普萘洛尔后发生低血压，因此为了最大限度地提高未来试验的成功率，仔细考虑β-受体阻滞剂的剂量递增方案是至关重要的。考虑使用从基线水平降低的百分比，而不是绝对值作为增加药物剂量的参考标准或许是未来解决药物剂量的方向。总而言之，Hiller JG等人的研究从分子水平上证实了术前应用β-受体阻滞剂普萘洛尔或许可以降低乳腺肿瘤的侵袭性，但是否真的可以改善乳腺肿瘤患者远期预后，以及是否可以推广至其它肿瘤类型仍需要更多高质量的研究来验证。（编译：刘溪；审校：张军，缪长虹）
原始文献：1.Hiller JG, Perry NJ, Poulogiannis G, Riedel B, Sloan EK. Perioperative events influence cancer recurrence risk after surgery. Nat Rev Clin Oncol 2018;15(4):205-18. 2.Qiao G, Bucsek MJ, Winder NM, Chen M, Giridharan T, Olejniczak SH, et al. Beta-Adrenergic signaling blocks murine CD8(+) T-cell metabolic reprogramming during activation: a mechanism for immunosuppression by adrenergic stress. Cancer Immunol Immunother 2019;68(1):11-22.
3.Black DS, Cole SW, Christodoulou G, Figueiredo JC. Genomic mechanisms of fatigue in survivors of colorectal cancer. Cancer 2018;124(12):2637- 44.
4.Knight JM, Kerswill SA, Hari P, Cole SW, Logan BR, D'Souza A, et al. Repurposing existing medications as cancer therapy: design and feasibility of a randomized pilot investigating propranolol administration in patients receiving hematopoietic cell transplantation. BMC Cancer 2018;18(1):593.
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