绕开肿瘤异质性，直面免疫异质性！

弥漫性神经胶质瘤是最常见的原发性人类脑肿瘤，并且仍然无法治愈。目前的治疗很大程度上未能防止主要类别的弥漫性胶质瘤——异柠檬酸脱氢酶 (IDH) 突变型胶质瘤 (IDH-G) 和IDH野生型胶质母细胞瘤 (GBM) 的复发，可能是由于恶性细胞显着的遗传和细胞异质性。内源或治疗诱导的 T 细胞反应通常针对不同的肿瘤抗原，提供了通过 T 细胞介导的免疫治疗异质性肿瘤（如弥漫性神经胶质瘤）的潜力。

在顶级期刊Cell杂志上题为Inhibitory CD161 receptor identified in glioma-infiltrating T cells by single-cell analysis的论文中，研究人员对 31 名 GBM 成年患者新鲜肿瘤样本进行单细胞测序，并通过 T 细胞图谱来识别调节弥漫性神经胶质瘤中 T 细胞功能的新途径，鉴定出 NK 基因KLRB1（编码 CD161）作为潜在的抑制受体。CLEC2D 是 CD161 的配体，是一种由骨髓细胞和恶性细胞表达的表面分子，提示免疫治疗的配体-受体途径。

体外和体内实验表明，CD161 受体在抑制 T 细胞功能的关键作用，包括抑制细胞毒性和细胞因子分泌。因此，该研究涵盖了主要类型的弥漫性神经胶质瘤，并通过单细胞测序等实验将 CD161-CLEC2D 通路确定为弥漫性神经胶质瘤和其他人类癌症免疫治疗的潜在靶点。我们下载了 TCGA 中 GBM 的 60 个文件，并进行了 SNC 分析。根据结果，所选样本中，GBM 患者 IDH1 的突变比例只有 9%，远低于常见的PTEN、TP53、EGFR 和 TTN 等。

但是，协同/互斥分析表明，IDH1 突变与 TP53 和 ATRX 等突变存在显著的协同现象。TP53是 DNA 损伤修复酶；ATRX 是一种转录因子，是 ATP 依赖的解旋酶。研究发现，ATRX 突变和 IDH 突变相伴。那么，这是否与肿瘤异质性有关，值得关注。

本研究的切入点是免疫检查点分子中的配体和受体，并利用单细胞测序技术，对 GBM 患者的肿瘤组织中 T 细胞图谱进行系统性全景绘制。这样，研究者就非常巧妙地避开了遗传或者表观等肿瘤异质性，而是非常直接地关注于免疫异质性，从而发现并鉴定了新型免疫检查点配体和受体通路。

今天给大家分享2022年5月发表在Genome Biology上的一篇单细胞测序文章, 题目名为Refining colorectal cancer classification and clinical stratification through a single-cell atlas, 作者通过单细胞测序的方法，全面分析了结直肠癌亚型和临床分层。结直肠癌 (CRC) 的单细胞研究试图提供 CRC 景观的全局视图。然而，迄今为止，尚未完全表征肿瘤细胞和 TME 如何塑造导致特定 CRC 亚型的肿瘤、间质和免疫景观的深入系统表征。

国际联盟发布了共识分子亚型(CMS, consensus molecular subtypes) ，根据转录组数据将 CRC分为CMS1（MSI 免疫）、CMS2（典型）、CMS3（代谢）和 CMS4（间充质）四型。结直肠癌共识分子亚型具有不同的免疫学、基质细胞和临床病理特征。借助 CMS 肿瘤微环境进行单细胞表征，以阐明肿瘤和基质细胞对发病机制的贡献，这可能会促进亚型特异性治疗的发展。本研究通过探索不同种族的人类CRC 样本，并分析多个独立的外部队列，共计 487829 个单细胞，从而高分辨率描述肿瘤微环境细胞内的细胞多样性和异质性。

肿瘤细胞含有单个 CMS 亚群，但表现出显着的瘤内 CMS 异质性。CMS1 微卫星不稳定性 (MSI-H) CRC 和微卫星稳定 (MSS) CRC 在肿瘤上皮水平表现出相似的通路激活。然而，MSI-H CRC 中的 CD8+ 细胞毒性 T 细胞表型浸润可以解释为什么这些肿瘤对免疫检查点抑制剂有反应。CRC 中的细胞转录组学概况存在于肿瘤免疫基质连续体中，这与利用bulk Sequencing研究提出的离散亚型形成对比。

为了确定和剖析 CRC 患者的肿瘤、免疫学和间质异质性的程度，本研究对 16 个种族不同、未接受过治疗的 CRC 患者组织样本和 7 个相邻的正常结肠组织样本（共 23 个样本）进行了基于液滴的 scRNA-seq。聚类分析确定了稳健、离散的上皮细胞簇（EPCAM+、KRT8+和KRT18+)、成纤维细胞 ( COL1A1+ )、内皮细胞 ( CLDN5+ )、T 细胞 ( CD3D+ )、B 细胞(CD79A+ ) 和基于典型标记基因的髓样细胞 ( LYZ+ )。

肿瘤细胞异质性：肿瘤上皮细胞表现出瘤内 CMS 异质性并驱动免疫细胞浸润。CMS1表现出免疫、蛋白酶体、JAK-STAT 和 PD-1 信号通路的富集增加；CMS4表现出上皮-间质转化 (EMT)、VEGF 和 TGF-β 激活等通路。CMS2表现出由 MYC 和 DNA 修复基因的拷贝数改变驱动的基因表达。此外，CMS2 与调节代谢、细胞周期多种途径的显着变异和富集相关，证实 CMS2 是各种 CMS 亚组中异质性最强的。CMS3显示 KRAS 信号在其转录组水平上调，证明免疫学和免疫逃避特征（JAK-STAT 信号），暗示该亚型并非完全免疫缺陷。

成纤维细胞异质性：在重新聚类和分析高质量成纤维细胞时，在所有四个数据集中识别并按表型将 CAF 分为粘连/伤口愈合/CAF-S1、血管周围/CAF-S4 亚型。CAF-S1是通过成纤维细胞特异性标记物 (FAP、PDPN、PDGFRA)的表达来鉴定的，并进一步分为 (a) 肌成纤维细胞 (myCAF)，胶原蛋白相关基因（COL1A1 和 COL1A2）和成纤维细胞标记物（FAP、PDPN）表达增强，和 (b) 炎症 (iCAF) 亚型（表达趋化因子如CXCL12）。而肿瘤细胞和成纤维细胞的异质性，导致了结直肠癌不同CMS之间也存在髓系细胞和T细胞的异质性（免疫异质性）。

使用 cellphoneDB进行配体、受体互作分析，研究人员发现 CAF 和 C1q+ TAM 的相互作用导致T 细胞功能障碍和 M2 样极化相关的特征，其中主要涉及免疫检查点CD40LG:CD40、TIGIT:NECTIN2、CD74:COPA、CD28:CD86、SIRPA:CD47 和 CD86:CTLA4。CTLA4介导的来自抗原呈递细胞的共刺激分子 CD86 的反式内吞作用降低了 APC 共刺激 T 细胞的能力。TAM-T 细胞通过 TIGIT-NECTIN2 相互作用，导致肝细胞癌的免疫抑制。CD8+ T细胞表达 M2样极化诱导基因CD74:MIF、SIRPA:CD47，促使巨噬细胞趋向抑癌。因此，与肾癌类似，结直肠癌CD8+ 和 C1q+TAM 细胞之间也存在双向抑制性串扰，呈现为免疫抑制微环境。

CAF 亚型和各种 CD8+ T 细胞之间存在不同和共同的免疫检查点相互作用。例如，TIGIT-NECTIN2 关系在 CAFS1 亚型和 CD8+ T 细胞之间共享，但 T 细胞配体-受体抑制信号 LGASL9-HAVCR2特定于 ecm-myCAF 和 CD8+ GZMB 对。

CAF-S1 和 TAM 相互作用由 CAF-S1 表达的 C3 和 CSF1 分子以及 TAM 受体 C3AR1、CXCR4 和 SIRPA 介导。此外，通过 MIF-CD74 的 CAF-TAM 相互作用增加了 CAF 中的 CD44 结合，导致 ERK1/2 激活，从而促进增殖并抑制细胞凋亡。

因此， 不同的 CAF 和 C1Q+ TAM 足以解释 CMS 的预测能力，且基于这些细胞表型的特征可以更精确地对 CRC 患者的预后进行分层。治疗性靶向特定 CAF 亚型和 C1Q + TAM 可能会促进 CRC 患者的免疫治疗反应。