编者按
癌症转移是癌症难以治愈的关键原因。《Cell》上的一篇文章，通过11年的持续追踪，获得各个转移癌样本，因而可以直观地观察到癌症转移进化史，结合免疫情况，比较准确地预测各个转移灶是否会复发。这样的结果证明了精准治疗的必要性，为后续工作如克隆分类、干预治疗、克隆分治提供了基础。以下是详细解读。
文章题目：《Evolution of Metastases in Space and Time under Immune Selection》
期刊名称：《Cell》
研究人员：巴黎索邦大学综合癌症免疫实验室Jérôme Galon团队
影响因子：31
发表时间：2018.10
研究亮点
长时间跟踪分析肿瘤克隆进化，确立了一个平行选择模型，可以解释免疫编辑如何控制转移癌发展。
研究背景
研究人员假设肿瘤细胞的转移进展和克隆进化，遵从达尔文的自然选择理论，即选择具有低免疫原性和抗免疫攻击的肿瘤细胞变体，而高免疫原性肿瘤克隆则被根除。依据这样的假设，研究人员试图根据转移性结直肠癌（CRC）11年的随访，确定免疫压力如何影响转移肿瘤的进化。研究人员描述了不断演变的转移基因组和免疫微环境，以及免疫监视和逃避与克隆的散播和进展如何结合；同时，构建了转移过程中肿瘤进化的平行选择模型，局部免疫应答的强度和质量影响最终转移进展。
实验框架
研究人员选取了两例IV期CRC患者的31例转移灶样本作为纵向数据集，这两名患者存活时间极长。疾病进展中，对两名患者P210和P45的转移灶内与灶间不同时间进行取样（图1A），共36个样本，包括完全切除的原发肿瘤，同时期和异时期转移灶，对这些样本进行了基因组和肿瘤微环境表征。P45的M8转移灶连续采集了a、b两个样本。P210的M7转移灶采样了坏死区（necrotic, M7n）和周围肿瘤组织（M7），M10块状转移灶采样了四个区域b1-4。
图1A 两名患者样本采样解剖示意图
免疫组化（IHC）淋巴谱系标记物用来定量评估免疫微环境（图1B），包括三个指标：全片扫描免疫细胞密度（whole-slide immunecell densities, WS），三个最严重浸润热点（hotspots, HS）密度，以及瘤心（center of tumor, CT）和瘤边（invasive margin, IM）的CD3+/CD8+ T细胞密度计算得到免疫分数。7层免疫荧光标记物复合成像用于绘制肿瘤微环境中免疫细胞的空间分布（图1C）。
图1B,C 免疫组化全片数字扫描和标记物复合荧光成像
全外显子组测序应用于相应的血液样本、切除的原发性和连续转移样本。
进化图确定CRC转移传播途径
研究人员使用Parsimony Ratchet方法构建了系统发育树（图2A），数据来源为原发和转移样品中一致的非沉默点突变。总体而言，与从解剖学上区分的转移相比，来自相同转移位置的样本，在系统发育上更接近并且共享更多突变。
图2A 基于原发和转移样本一致突变的系统发育树
接下来研究人员根据编码突变谱的相似性，推断出每个转移的起源，由最大Jaccard相似系数定义亲子关系。转移灶传播途径使用转移灶进化枝树形图表示（图2B）。由上到下为第一次确诊到最后一次随访，每个样本用圆圈表示，大小表示肿瘤尺寸，外圈颜色为切除位点，内圈颜色表示免疫指数（HS和WS）。在患者P210中，肿瘤部位M10-b3是大体积转移M10的组成部分，但其起源不同于从相同转移（M10-b1，-b2和-b4）取样的其余区域，表明M10是多步定植的结果。值得注意的是，在两名患者中，均只有一例同期转移扩大为转移谱系：P210中的M06和P45中的M03，表明一些转移灶比其他转移灶更具攻击性。
图2B 转移灶传播树形图
基因组印记变化方面，通过将测序覆盖度、亲本拷贝数和肿瘤纯度整合，来估计给定体细胞突变的细胞流行率，可计算得12种不同的肿瘤克隆，结合遗传算法可得（图3C），以颜色区分不同肿瘤克隆。原发性肿瘤的创始克隆未被检测到，可能是由于原发肿瘤的取样有限。然而，疾病进展期间最持久的克隆可追溯到原发性肿瘤。
图3C 肿瘤克隆进化图
免疫微环境
为了阐明免疫背景，作者通过单重IHC、多光谱成像和多重免疫基因表达来检测肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）。总体而言，患者内每种表型的差异相对较大（图4A）。
图4A 免疫细胞密度柱状图
免疫指数和免疫编辑描绘逃逸机制
研究人员单独评估了每个转移的免疫编辑评分，这是由观测对比预期免疫原性突变比例得到的。高于预期的免疫原性率，表明缺乏免疫编辑和免疫耐受性（得分> 0.8，n = 24）。几处转移灶都显示出存在重要免疫编辑的证据，即免疫原性突变的频率低于预期（得分≤0.8，n = 7）。之后，通过绘制免疫编辑评分（Yes/No）和相应的免疫指数（Hi / Lo），研究人员将转移灶定义成四类（HiYes、HiNo、LoYes和LoNo，图5A）。引人注目的是，没有一个转移灶对应于低免疫指数和有免疫编辑（LoYes）组。支持弱适应性免疫不足以进行免疫编辑的观点，低免疫指数和免疫编辑是相互排斥的（LoNo，n = 18）。相反，仅在具有炎性T细胞表型和高免疫指数（HiYes，n = 7）的转移灶中观察到免疫编辑，并且由于主动免疫选择产生了新抗原耗尽。然而，只有54％具有高免疫指数的转移灶是免疫编辑过。该结果表明免疫浸润是必要的，但不一定足以进行免疫编辑。
图5A 免疫指数和免疫编辑评分四象图
有趣的是，具有低免疫指数和无免疫编辑的转移灶更易于复发，并且在64％的病例中产生了一个子代转移，只有8％的转移灶具有高免疫指数。此外，未编辑的转移灶有较高的倍性水平（r = 0.55，p <0.001，图5B）。相反，与未经编辑的转移灶相比，具有高免疫指数的免疫编辑转移灶因有高密度记忆T细胞（CD45RO）和增殖T细胞（CD3 + Ki67 +），以及更高的突变IMH（mIMH）而得以区分（图5C）。
图5B-D 三组转移灶不同免疫特征箱线图
鉴定存在TIL却没有免疫编辑的一组转移灶（HiNo，n = 6）揭示了几种瘤外逃逸作用。HiNo组的CT和IM中，FOXP3 +细胞和PD-L1 +细胞增加（图5C）。高TCR-α多样性提示该组中T细胞克隆扩增缺失或稀缺（HiNo相对于HiYes增加5.5倍，相对于LoNo的主要和显着差异）（图5D）。
除了免疫细胞密度，研究人员还探索了整个肿瘤切除术中不同细胞表型的空间分布，测量了细胞表型之间的相邻距离，并计算了最近邻距离的交叉型累积分布G（r）。免疫学编辑组中，CD3 T细胞和增殖肿瘤细胞（CK + Ki67 +）的差异空间组织区分出来（图5E）。复合荧光图像（图5F）和交叉型距离的累积分布G（r）标明了转移灶中增殖肿瘤细胞CK + Ki67 +和CD3 + T细胞的空间定位（图5G）。实际上，HiYes组在CD3 +和CK + Ki67 +细胞之间具有较短的平均相邻位置距离（图5H），CT中增殖的肿瘤细胞平均有一半具有25mm半径内的周围CD3 +细胞（图5H）。对于HiNo转移灶，研究人员发现在CT和IM中， T细胞（CD3 +）和肿瘤细胞（CK +）存在近距离PD-L1的的百分比更高。因此，免疫编辑的转移灶具有高免疫指数、T细胞与增殖的肿瘤细胞之间距离短的特点，而非免疫编辑的转移灶FOXP3 + T细胞密度增加，PD-L1高表达，以及T细胞与PD-L1 +细胞的显著接近。
图5E-H 三组转移T细胞瘤细胞空间分布模式体、复合荧光图像、累计分布距离和各表型细胞箱线图
免疫指数和免疫编辑影响转移癌进展
为了解肿瘤复发风险特征，根据肿瘤克隆是否已经产生子代转移将肿瘤克隆分为三组（持续型、消除型和早期非复发性）。研究人员通过几种基因组特征比较了持续型和消除型肿瘤克隆，包括Dn / Ds评分作为非沉默突变选择压力的指标，它们都与肿瘤克隆的复发状态不相关。继而研究人员计算了肿瘤克隆的免疫编辑评分。引人注目的是，免疫编辑在消除型肿瘤克隆中更常见，而免疫编辑的缺失是持续型克隆的特征（图6A）。值得注意的是，只有一个持久型克隆，来自P45的克隆2，具有免疫编辑。事实上，这个克隆只有一个位于ZDHHC11基因内的免疫原性突变，其表达水平可以忽略不计。
有趣的是，主要克隆（克隆4）具有免疫原性，有免疫编辑并被消除，不再出现。此外，免疫选择区分消除型克隆和持续型克隆比正选择（Dn / Ds评分）更好（图6A）。免疫编辑是肿瘤克隆复发的最佳预测因子（AUC = 0.89），并且如果不考虑P45的克隆2则具有更好的性能（AUC = 0.98）。在具有异时转移的卵巢癌病例中观察到类似的结果。
图6A 免疫编辑区分三型肿瘤克隆
最后，研究人员检验了哪些参数也可能具有临床相关性，包括临床、基因组、免疫和空间等22个参数进行了单元变量分析。有效的两个最佳预测因子是免疫编辑和免疫指数（图6B）。单元变量分析的显著参数协变量选择产生了四个协变量（图6C），其中之一，CT中的CK +Ki67 +和CD3 +细胞间距离，在多元变量模型中不显著。根据该模型，较低的免疫指数，免疫编辑的缺失和较高的转移负荷对无复发存活率具有不利影响。通过将免疫编辑和免疫指数叠加在转移的系统发育树上，来评估免疫系统与肿瘤随时间的传播之间的关系（图6D）。这说明了转移灶的局部控制（较小的尺寸）和免疫指数在预防复发中的保护作用。因此，转移进展和复发时间取决于机制相关的免疫参数（图6C）。
图6B,C 预测模型和风险因子
图6D 叠加免疫编辑和免疫指数的系统发育树
然后，研究人员生成了转移性癌症进展的预测时间-事件模型，以估计复发的概率。2016年1月最后一次随访，出具的临床结果显示，两名患者在当时均完全缓解且无疾病。该模型是在2016年1月之后对临床结果进行探索性建立。每种类型转移的累积复发概率随时间的变化（图6E）。因此，具有最高复发概率的转移灶具有大尺寸，低免疫指数，并且没有免疫编辑。相反，风险最低的组包括具有高免疫指数和低负荷，并且经过免疫编辑。
图6E 不同分组的复发预测模型
将预测模型应用于每个转移灶以量化其复发的概率（图6F）。根据预测的结果，几乎所有来自患者P210的转移灶都超过了复发风险的时间，而对于患者P45，有几个高风险样本，特别是最新的转移M15和M16。该模型预测截至2018年1月，P210发生新复发事件的可能性不到35％。事实上，P210至今仍处于完全缓解期。相反，估计P45的复发风险很高。两个腹膜转移M15和M16在2017年1月之前复发概率为95％，在2018年1月之前复发概率为99％。与模型预测一致，2016年4月患者P45被诊断为复发，特别是腹膜和肝脏中几处不可切除的转移性病变。
图6F 复发概率模型
讨论
基于特长生存期（超过11年）以及相对大量的切除样本，研究人员可以探究复发的驱动因素，并追踪进化动力学，确定每个转移和每个克隆的起源，区分转移是否复发和被消除。这些转移/克隆的比较揭示了免疫系统对转移复发的几个作用。
首先，每个转移灶本身就是一种疾病，位置和时序不同的转移灶，甚至同一转移灶内都有有不同的临床反应、基因组结构和免疫活性，患者的转移灶不能平均化处理。
其次，研究人员描述了转移进展的克隆演化图，用以追踪多种传播途径，包括多步定植、多态和多克隆种子以及线性和平行进展的遗传证据。然而，当仅考虑基因组学特征时，肿瘤克隆是否易于传播并不能很好的得到回答。
第三，研究人员因此分析了免疫微环境，证实了转移克隆免疫原性和免疫编辑的关键异质性。消除的克隆是免疫编辑过。持续存在和进展的肿瘤克隆具有免疫特权，无论是未经编辑的还是非免疫原性的。这一发现首次揭示了持久性细胞是可识别的，因此可治疗靶向。靶向克隆新抗原可以通过针对保留免疫原性突变的、未编辑持续存在肿瘤克隆来预防复发。
第四，研究人员虽然甚至可以在疾病时间表中检测到有效的免疫激活和高免疫，但随着时间的推移，免疫编辑的总体下降趋势意味着肿瘤获得逃逸机制。实际上，非整倍性与缺乏免疫编辑有关。越来越多的证据表明，在获得大量突变之前，染色体不稳定性可能是转移的早期驱动事件，患者P45便是如此，这可能导致新抗原的稀释浓度和自身肽对抗原呈递的竞争优势。在这种情况下，监视的免疫细胞募集将被沉默，免疫编辑将是不可检测的（LoNo组）。此外，研究人员发现具有高免疫浸润的未经编辑的转移灶（HiNo）也具有高倍性。他们认为这种情况是因为肿瘤细胞已经充满新抗原，染色体不稳定性属晚期事件。在足够强的新抗原信号后，免疫细胞可以被募集，但受到免疫抑制的抑制，导致无法检测到免疫编辑。实际上，在TIL（HiNo）存在下缺乏免疫编辑揭示了几种逃避机制，包括增加免疫抑制细胞的密度和分离免疫与肿瘤细胞。
最后，免疫指数、转移灶大小和缺乏编辑，是复发的预后因素。研究人员构建的转移性癌症进展的预测模型，可以正确预测两名患者的复发风险，也成功在另外的独立数据集上得到验证。
总之，研究人员发现了免疫系统影响肿瘤异质性和克隆进化的证据。
参考文献：
[1] Jérôme Galon, Mihaela Angelova, et al. Evolution of Metastases in Space and Time under Immune Selection[J]. Cell, 2018,VOLUME 175, ISSUE 3, P751-765.E16
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