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近几十年来，为了提高局限期非小细胞肺癌（NSCLC）根治性手术切除后的治愈率，临床在不断完善其辅助治疗模式，除了传统的放化疗外，也引入了新型靶向治疗和免疫治疗。然而，简单的一刀切策略和长期的治疗周期会给大部分患者带来不必要的毒副作用和相当大的心理负担。因此，临床亟需一种能准确预测疾病复发风险的技术，比如ctDNA-MRD，来决定是否需要进行辅助治疗。
近日，《Cancer Discovery》发表了一项大型前瞻性、非干预性、观察性I-III期肺癌术后ctDNA-MRD研究结果，结果显示：纵向ctDNA-MRD检测为阴性的患者可以定义为潜在的治愈患者，并且无法从辅助治疗中受益。ctDNA-MRD转阳或复发的高峰期在术后第12-18个月左右，提示临床应至少密切观察18个月。如果ctDNA-MRD持续阴性至第18个月后，其复发风险逐渐降低。1
该研究共纳入261例I-III期（肿瘤直径≥2cm）NSCLC患者，经过根治性手术切除后进行术后动态血液ctDNA-MRD检测，其中术前血液样本261例，术中肿瘤组织256例，术后血液样本652例。在这项研究中，系统地回答了以下四个问题：1）Nonshedding tumor（非脱落肿瘤）问题；2）ctDNA-MRD PPV及NPV问题；3）ctDNA-MRD灵敏度问题；4）ctDNA-MRD指导辅助治疗问题。
▲ 患者纳入亚分析流程图，系统回答了临床上四个问题
ctDNA-MRD检测策略：（非完全）Tumor-agnostic assays策略，固定panel；
检测panel：使用类似CAPP-seq panel的设计概念，开发了一款固定化338基因MRD panel，大小为0.55Mb，专门用于肺癌、结直肠癌和肝细胞癌（设计原则是三种癌症类型中最常见的驱动基因 + 免疫治疗相关敏感/耐药基因 + Geneplus近5万相关癌症数据库及COSMIC和TCGA数据库中的热点突变区域）；基线肿瘤组织检测为1,021基因大panel，大小为1.5Mb；
检测样本：肿瘤组织样本（新鲜冷冻组织/FFPET），血浆cfDNA样本（20ml全血）；
样本input量：gDNA为400~800ng；cfDNA为52ng（中位值）；
建库方法：探针杂交捕获法（IDT），其中cfDNA建库添加UID接头；
测序平台：DNBSEQ-T7RS测序仪（MGI）或Gene+Seq-2000测序系统（吉因加）
测序深度：肿瘤组织样本平均测序深度为1,214X，检出中位突变数为6个（1-93）；血浆cfDNA样本平均测序深度为30,000X；
cfDNA LoD：变异等位基因频率（VAF）的LoD为 0.1%；
ctDNA-MRD分析：检测到至少一种变异的血浆样本被定义为ctDNA-MRD阳性。其calling有两种方式，一种是Tumor-informed calling，一种是Tumor-naïve calling。其中肿瘤组织衍生的变异，在血浆ctDNA中判断的话，驱动基因需要≥2条reads，乘客基因需要≥4条reads，如果非肿瘤组织衍生的变异，判断标准会高一倍，驱动基因需要≥4条reads，乘客基因仅需要≥8条reads；
ctDNA-MRD检测样本采集情况： 研究者在术前和术后预先设定的时间点，分别使用两支10ml的streck管采集外周血20ml。手术前3天采集术前血液样本。未接受辅助治疗的患者以术后1个月（±7天）为landmark（界标）时间点。对于接受辅助化疗的患者，辅助治疗前时间点定义为手术后及辅助治疗前至少1周，landmark时间点为最后一个化疗周期后1个月（±7天）。对于长期接受EGFR抑制剂或ICIs辅助治疗的患者，landmark时间点为手术后及辅助治疗前1个月（±14天）。Longitudinal（纵向）时间点为landmark检测后每3~6个月一次。Surveillance（监测）时间点为临床复发前6个月内的检测。由于前瞻性的影像学随访和采血在同一时期，监测时间点可能与临床复发在同一天。
*Landmark：界标时间，即术后/辅助治疗后1个月内的单点检测
Longitudinal：纵向时间，即Landmark检测后每隔3-6月进行一次检测
Surveillance：监测时间，即临床复发前6个月内进行的检测
该研究的主要发现有：
1）Nonshedding tumor（非脱落肿瘤）问题：
考虑到肿瘤的存在，术前ctDNA检测可用于评估每个个体的肿瘤DNA脱落情况。所有入组患者（261例）术前均成功进行ctDNA检测，然而只有36.4%（95例）是阳性的（中位VAF为0.71%），这么低的阳性比例可能与肿瘤自身脱落DNA有关，也可能与检测方法灵敏度不够有关。
为了进一步阐明ctDNA的检测性能和肿瘤的非脱落性问题，研究者进一步对11例 I 期患者，术前2轮外周血ctDNA检测，术中通过肺叶标本切除下来后收集肺叶静脉残端血检测ctDNA，两种ctDNA检测显示100%一致。其中6例患者肺叶静脉残端血和外周血ctDNA检测均为阴性，证实了确实存在肿瘤本身不释放ctDNA的Nonshedding肿瘤的存在。另外，5例肺叶静脉残端血ctDNA阳性，其中3例外周血ctDNA只有1轮阳性，这也提示目前的技术手段对低频突变（特别是VAF<0.05%）的检测灵敏度是不足的。
▲ 11例I期NSCLC患者：2轮外周血ctDNA vs 肺叶残血ctDNA
更为重要的是，术前血液中检测不到ctDNA似乎并不影响其监测疾病复发的有效性。41例复发性ctDNA-MRD阳性患者中，14例（34.1%）术前ctDNA检测为阴性。相反，所有ctDNA-MRD未检测到的复发患者术前ctDNA检测均呈阳性（6/6，100%）。
▲ 通过复发患者反推术前ctDNA与术后MRD检测及复发关系
2）ctDNA-MRD PPV及NPV问题：
术后单点（landmark）ctDNA-MRD的PPV达81.0%，NPV达86.6%，纵向分析可进一步提高准确度，纵向（Longitudinal）ctDNA-MRD的PPV可达89.1%，NPV可达96.8%，意味着术后ctDNA-MRD持续阴性，其复发的可能仅为3.2%。纵向ctDNA-MRD检测为阴性的患者可以定义为潜在的治愈患者（与术后单点检测相比，纵向分析曲线近乎完美）。
此外，对II-III期肺癌患者术后的ctDNA-MRD动态分析发现，ctDNA-MRD转阳或复发的高峰期在术后第12-18个月左右，提示临床应至少密切观察18个月。如果ctDNA-MRD持续阴性至第18个月后，其复发风险逐渐降低，可定义为潜在治愈人群。
▲ ctDNA-MRD转阳或复发的高峰期在术后第18个月左右
3）ctDNA-MRD灵敏度问题：
术后单点（landmark）的ctDNA-MRD灵敏度为36.2%，纵向（Longitudinal）时间点的ctDNA-MRD灵敏度可提高到87.2%。这也提示：就目前而言，单次术后ctDNA-MRD检测的灵敏度是小于50%的，持续的纵向ctDNA-MRD检测可大幅提高其灵敏度。
4）ctDNA-MRD指导辅助治疗问题：
术后ctDNA-MRD检测阴性患者的肿瘤负荷极低，辅助治疗可能对这些患者是不必要的。术后辅助治疗前ctDNA-MRD检测阳性的患者，辅助治疗可以改善其DFS，但是对于ctDNA-MRD检测阴性的人群，辅助治疗无获益。识别和避免对潜在治愈人群的过度治疗是一个重要的临床问题。
另外，该研究也存在一定的局限性。1）随访时间较短（中位随访时间为19.7个月）。在该项研究中，只有47例复发。2）landmark检测后没有严格按照每3-6个月进行ctDNA-MRD随访。然而，该研究证实了ctDNA-MRD的预后价值具有足够的统计学意义。
总体而言，在这项前瞻性研究中，研究团队证实了基于ctDNA的MRD评估对NSCLC根治术后患者的预后价值。同时，研究团队还强调了ctDNA-MRD纵向分析的临床应用价值：ctDNA-MRD阴性可以用于确定局部NSCLC的潜在治愈患者。此外，亚组分析提示，ctDNA-MRD阴性的患者可能不需要辅助治疗。最后，研究团队指出，脑复（转）发（移）仍然是NSCLC ctDNA-MRD监测的一个主要挑战，未来是否会考虑CSF-MRD进行监测？
参考资料：
1.Jia-Tao Zhang, Si-Yang Liu, Wei Gao, Si-Yang Maggie Liu, Hong-Hong Yan, Liyan Ji, Yu Chen, Yuhua Gong, Hong-Lian Lu, Jun-Tao Lin, Kai Yin, Ben-Yuan Jiang, Qiang Nie, Ri-Qiang Liao, Song Dong, Yanfang Guan, Pingping Dai, Xu-Chao Zhang, Jin-Ji Yang, Hai-Yan Tu, Xuefeng Xia, Xin Yi, Qing Zhou, Wen-Zhao Zhong, Xue-Ning Yang, Yi-Long Wu; Longitudinal Undetectable Molecular Residual Disease Defines Potentially Cured Population in Localized Non–Small Cell Lung Cancer. Cancer Discov 2022.
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