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Graphical abstract
研究目的 本研究通过探索肺腺癌（LUAD）中的肿瘤内真菌生物群，并提出一种驻留在肿瘤中的活真菌促进肿瘤作用的机制见解。，从而证实肿瘤内的真菌生物群，即使生物量较低，但其在刺激免疫抑制的肿瘤微环境（TME）方面发挥了重要作用，从而促进了肺癌的进展，并与患者的不良预后有关。 研究背景 虽然肠道微生物群一直处于研究的前沿，但多种肿瘤与微生物群共存，导致全球肿瘤的复杂性和构成。然而，TME的驱动机制还没有得到系统的研究，尽管人们认识到“多态微生物群”是癌症的一个新的标志，但人们对肿瘤内真菌生物群作为活性微生物在癌症进展中的作用知之甚少。肺细菌微生物区系失调与肺癌的发生和发展有关。最近的研究发现了35种癌症类型的肿瘤内真菌菌群。免疫抑制TME表现出明显的异质性，是肿瘤进展的关键促进剂。免疫抑制TME的主要成分，如髓系来源的抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞和调节性T细胞(Treg)等细胞及过程，会对T细胞的功能产生重要影响，从而促进肿瘤的进展。 研究方法 本研究使用真菌富集的DNA提取和深鸟枪宏基因组测序，在LUAD患者中鉴定了肿瘤驻留曲霉菌A.sydowii。通过三种不同的同源癌症小鼠模型，研究发现A.sydowii通过IL-1b介导的MDSCs的扩增和激活来促进肺肿瘤的进展，导致细胞毒性T淋巴细胞的活性被抑制和PD-1+CD8+ T细胞的积累。这是通过β-葡聚糖/Dectin-1/CARD9途径分泌的IL-1b介导的。对人类样本的分析证实，富集的A.sydowii与免疫抑制和患者不良的预后有关。 研究结果 1. 瘤内真菌菌群失调与LUAD病理相关，并富含活真菌 利用荧光原位杂交(FISH)对真菌载量进行了评估，发现LUAD肿瘤组织中定植真菌的丰度明显高于匹配的非肿瘤组织；然后在测序分析过程中使用Decontam R包去除了污染的DNA序列，发现肿瘤组织的基于Ace和Chao指数的α多样性明显低于非肿瘤组织。这些数据显示了LUAD患者的肿瘤内真菌菌群失调，在侵袭性更强的实体、微乳头和乳头占主导地位的亚型中，差异更大，这表明真菌菌群失调与LUAD侵袭性之间存在潜在的相关性。从7名额外选择的LUAD患者的新鲜肿瘤组织中分离出3株活真菌，并确认为A.sydowii。两条独特的途径，即氨基糖和核苷酸糖代谢(Ko00520)和cGMP-PKG信号通路(Ko04022)，与肿瘤组织中Sydowii的存在呈正相关。研究有力地揭示了LUAD患者真菌菌群格局和功能特征的变化，并确认存在丰富的肿瘤常驻活A.sydowii。 2. 肿瘤驻留A.sydowii通过诱导免疫抑制的TME促进肺癌进展 使用了瘤内注射A.sydowii 建立的Lewis肺癌(LLC)小鼠模型。研究发现，与烟曲霉菌和白色念珠菌相比，它独特地加速了LUAD的进展，表现为肿瘤体积和肿瘤重量的增加。用FISH方法验证瘤内金黄色葡萄球菌的持久性。一致地，LLC细胞在用A.sydowii处理后显著地促进了增殖。这些数据表明A.sydowii在肺癌进展中的功能作用。使用流式细胞计数肿瘤组织中MDSCs(CD11b+Gr1+)比例显著增加，尤其是PMN-MDSCs(CD11b+Ly6G+Ly6Clow)比例明显增加，A.sydowii暴露的小鼠的TME中Tregs的比例更高，A.sydowii通过MDSCs和Tregs的局部扩张促进肺癌的进展，这两种细胞都是免疫抑制TME的关键成分。 3. A.sydowii在肺部的局部定植促进肿瘤进展 研究建立了原位LUAD小鼠模型，该模型更接近于LUAD的微环境，通过气管内接种KrasLSL-G12D/+/p53 fl/fl(KP)细胞，这些细胞以前从自发的KP LUAD小鼠中获得并体外扩增。随后验证了在肺实质内成功诱导肿瘤。研究发现A.sydowii持续且显著地促进了肿瘤的进展。A.Sydowii暴露增加了肿瘤结节中的真菌负荷，与LUAD患者肿瘤组织中的一致，并且，通过雾化吸入抗真菌药物（Amb）后，真菌菌群的枯竭将暴露在A.sydowii中的小鼠从加速的肿瘤生长中解救出来，有效地降低了肿瘤负担。 4. A.Sydowii诱导的免疫抑制是由TME中MDSCs活性增加所介导的 据报道，MDSCs可以诱导Tregs的扩张。将从A.sydowii治疗的肿瘤组织中分离的MDSCs与原代CD4+T细胞孵育后，使用Gr1单抗进行了体内MDSCs耗竭实验。用抗Gr1抗体去除MDSCs可显著减少经A.sydowii处理的LUAD小鼠模型的肿瘤生长，并显著降低MDSCs的丰度。A.sydowii诱导的免疫抑制促进肿瘤的作用是通过增加TME中MDSCs的活性来实现的。 5. A.Sydowii通过b-葡聚糖介导的Dectin-1/CARD9信号通路促进MDSCs成熟和活性 真菌病原体可通过模式识别β-葡聚糖受体Dectin-1及其下游接头蛋白CARD9诱导中性MDSCs。骨髓源性巨噬细胞(BMDM)与A.sydowii共培养的上清可促进其向MDSCs分化，并增强CARD9的表达，这与体内一致。 CARD9-/-BMDM对A.sydowii诱导的MDSCs分化具有抵抗力。我们始终观察到TME中有较小比例的Tregs和PD-1+CD8+T细胞。活性较低的MDSCs允许更多的细胞毒性T淋巴细胞介导的肿瘤细胞杀伤，从而减缓了肿瘤的进展。 6. 阻断IL-1b逆转A.sydowii诱导的免疫抑制 用超叶纯化的抗IL-1b单抗中和了BMDM和A.sydowii或b-葡聚糖共培养上清液中分泌的IL-1b。我们发现单抗阻断了共培养基对MDSCs分化的促进作用。IL-1b单抗治疗显著减少了A.sydowii治疗的LUAD小鼠模型的肿瘤生长(图6B)，并显著降低了MDSCs的丰度和PMN-MDSC与M-MDSC的比率。 7. 患者样本中A.sydowii的高丰度与免疫抑制和不良临床结局有关 对92例LUAD患者的肿瘤组织进行了FISH和免疫荧光染色，以探讨MDSCs、Tregs和PD-1+CD8+T细胞在TME中的分布，发现A.sydowii的高丰度与肿瘤浸润性MDSCs、Tregs和PD-1+CD8+T细胞的增加呈正相关。在LUAD患者中的这些结果与在小鼠LUAD模型中的发现一致。进一步的相关性分析发现A.sydowii的丰富与患者的侵袭性病理和淋巴结侵犯有关。分析了I、II、III和IV期的A.sydowii的丰度后观察到A.sydowii的丰度随着阶段的增加而增加。在分析A.sydowii的预后价值时，研究发现A.sydowii的丰度对患者的总体生存期(OS)和无进展生存期(PFS)进行了分层。 讨论 1. 肿瘤内的A.sydowii通过b-葡聚糖介导的Dectin-1/CARD9途径招募和激活MDSCs，从而特异性地促进肺癌的进展。此外，我们还证明，瘤内A.sydowii的富集性不仅与患者的肿瘤免疫表型有关，而且与患者的预后(OS，PFS)有关。这也得到了泛癌真菌生物群分析的支持 2. 因此，瘤内真菌生物群不仅可以作为LUAD进展的预后生物标志物，而且还代表了一个有价值的治疗靶点。 3. 宏基因组功能分析揭示了与粘膜免疫功能密切相关的生物合成和代谢途径中丰富的模块。然而，这些发现仅仅是观察性的。微生物群与宿主的相互作用是复杂的，取决于宿主免疫反应、微生物相互作用、环境条件等。理解潜在的原因机制需要进一步的研究，这鼓励我们探索肿瘤内真菌生物群，特别是A.Sydowii，在LUAD进展中的功能作用。 4. 在健康志愿者和接受肺移植的患者中，A.Sydowii经常从呼出的呼吸道冷凝物中分离出来。因此，A.Sydowii很可能是一个典型的肺共生体。考虑到口腔标本中检出Sydowii，本研究不能排除患者可能吸入真菌分生孢子，导致A.sydowii从口腔转移到BALF，继而转移到肿瘤部位，这是值得进一步研究的机制。 5. 研究发现瘤内A.sydowii的浓缩与CD8+T细胞上PD-1表达的增加有关，这代表T细胞的耗竭。鉴于肠道微生物区系可以影响患者对抗PD-1/PD-L1免疫治疗的反应，对霉菌群和MDSCs活性的调节可能为抗肺癌提供一种新的治疗策略，特别是在免疫治疗的背景下。 6. 在肺癌患者中，CARD9的过度表达与较短的OS有关，而有研究者则认为CARD9可能通过抑制MDSCs的产生而阻止肺癌的发展。受这些关于CARD9在肺癌中的作用的相互矛盾的数据的启发，本研究试图确定CARD9在A.sydowii诱导的LUAD进展中的作用，数据表明，CARD9在A.sydowii诱导的MDSCs分化和随后的肿瘤促进中是必需的，因为CARD9缺乏实际上可减少A.sydowii诱导的增强的LUAD进展。 7. 本研究不仅支持将真菌纳入最新的癌症微生物组“特征”，而且还可能作为肺癌的潜在预后标志和治疗靶点。 局限性 1. 尽管肠道和肺部真菌生物群之间存在着跨领域的相互作用，但这些发现仅仅是观察性的。不同微生物之间的复杂相关性取决于各种因素。未来需要进行系统性的研究； 2. 本研究并未对瘤内真菌生物群真正的毒力和共生适合性进行彻底的调查，因此并未充分揭示其在体内的调控作用； 3. 尽管研究揭示了瘤内A.sydowii在促进LUAD进展中的明显作用，但考虑到TME异质性的复杂性，A.sydowii到达人类肺部肿瘤的机制仍有待阐明，还需要进一步的全面研究； 4. 未来需要在LUAD的不同阶段用更大的样本量进行多队列验证。
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