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作者：肺癌前沿
编译：广东省肺癌研究所 姜林强
当前影像学表现为磨玻璃影(ground-glass opacities,GGOs )的早期肺癌日益增多，其中纯GGO (pure GGO, pGGO )局部切除术后预后较好。然而，最佳手术切缘仍存在争议。近日，北京协和医院李单青教授团队在浸润性肺腺癌切缘甲基化方面进行探索，以期为制定早期肺癌最佳手术切除范围提供更多信息和证据。
背景
目前pGGO组织学边缘以外的潜在癌前病变表观遗传变异模式仍有待发现和描述。本研究旨在描述表现为pGGO的早期浸润性肺腺癌 (LADC)结节的全基因组高分辨率DNA甲基化模式。此外，另一个目的是探索指示pGGO切除安全边界的甲基化标志物。通过分析这些组织的DNA甲基化谱，以确定在肿瘤核心和周围正常组织之间有显著差异的甲基化标记，并揭示它们在周围组织中根据距离肿瘤核心的距离所呈现的景象。
方法
选取15例诊断为早期LADC且具有pGGO CT特征的患者。每个入组患者分别采集肿瘤核心(TC)、宏观肿瘤边缘(显微镜下也确认为组织学肿瘤边缘(TE))、肿瘤外5 mm (P5)、10mm (P10)、15 mm (P15)、20 mm(P20)的肿瘤旁组织和周围正常组织(PN)的肿瘤组织（图1）。
DNA提取和甲基化测序
使用 QIAamp DNA FFPE组织试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)提取这些FFPE样本的 DNA。所有DNA甲基化图谱均通过还原亚硫酸氢盐测序(RRBS)方案绘制。
甲基化标记物鉴定和分析
使用Illumina bcl2fastq软件(https://support .illumi n a. )对读取数据进行多路解复用
DNA变异测序
应用next -seq500测序仪(Illumina, Inc.，CA, USA)进行靶向二代测序(NGS)。
统计分析
采用Wilcoxon秩和检验比较TC、TE、P5-20和PN样本地DNA基化标志物状态，后采用Benjamini-Hochberg (FDR)方法进行多重检验校正。根据所选标志物的甲基化水平，使用R包绘制热图和箱形图。采用 Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正。FDR p < 0.05 被认为具有统计学意义。
结果
临床特征和遗传谱
将15例早期LADC患者纳入研究。这些患者的临床特征列于表1。
所有手术标本均诊断为浸润性腺癌，并有不同的病理亚型。研究对象的平均年龄为52岁。15例患者中有11例为女性，仅有1例有吸烟史。所有病变CT表现为pGGO，平均直径1.51 cm (cm)。其中9名患者携带EGFR突变，1名患者携带EML4-ALK融合，1名患者携带ERBB2外显子20插入。9例提供足够肿瘤旁组织进行DNA变异测序的患者在TC和TE样本中具有相同的DNA变异。突变等位基因频率(MAF)低于TC和TE的2例患者P5中发现EGFR突变。在P5以外的其他肿瘤旁组织中未发现DNA改变。
肿瘤和非肿瘤组织中的DNA甲基化标记物
MTC >MPN为高评分标志物，MTC <MPN为低评分标志物。研究者共确定了2284个甲基化单倍型区组(MHBs)标志物(表2和图2)。
从热图中，无论TC、TE和肿瘤旁组织之间是否存在明确的转换(图3)，都可以观察到高分和低分标记的明显趋势。与肿瘤(TC和TE)相比，非肿瘤样本(P5-PN)中所有高分标记的甲基化评分都有所下降，而与肿瘤相比，非肿瘤样本(P5-PN)中低分标记的甲基化评分有所上升。
DNA甲基化标记从肿瘤到邻近组织的动态模式
根据其在肿瘤和肿瘤旁组织之间的动态变化，为此，研究者设计了一个度量K，根据DNA甲基化评分从肿瘤核心到肿瘤旁组织的趋势，根据K评分将所有鉴定的标记物分为两个亚组。K评分<1者称为“陡”(S)标记，K评分≥1者称为“渐”(G)标记(表2)。
86.2%的鉴定标记为S标记。这些标志物的水平在TE和P5组织之间的变化比TC和TE组织之间的变化更明显(图3、4)，从而模拟了这些组织之间的组织学变化。TC、TE、P5和PN患者MHBs的所有S标记和DMRs高分S标记的平均值均有显著性差异(FDR p < 0.05)。
TC、TE和PN的DMC S标记和DMR低评分S标记的平均值差异有统计学意义(FDR p < 0.05)。
此外，从MHB、DMC或DMR标记中随机选择了20个具有典型变异趋势的标记，以说明TC到肿瘤旁组织的甲基化水平变化(图5)。可以看到，除了P5之外，PN和肿瘤旁组织之间没有显著差异。一些S标记，在TC和TE组织之间具有大致相同的甲基化值(图5)。
占13.7%的其他标记是G标记，从TC到TE和肿瘤旁样本的变化是渐进的(图3,4)。对于G标记，TC和TE样本与TE和肿瘤旁样本之间的差异无显著性差异(从P5到PN) (p=0.132)。TC、TE、P5、PN患者MHB、DMC、DMR各项G指标的平均值差异有统计学意义(FDRp < 0.05)。除P5外，PN与肿瘤旁组织间无显著差异。由于这些标记物在TC中明显突出，而在P5组织中仅轻微减少，因此它们在P5中的存在强烈提示P5可能含有指示肺部恶性肿瘤的异常DNA甲基化(图5)。
基因本体(GO)富集DNA甲基化标记特征
分别对S标记、G标记、高分亚组和低分亚组进行GO分析。氧化石墨烯分析显示，在KEGG通路分析中，研究者发现在富含S标记或亚群的KEGG术语中，大多数术语与癌症密切相关。而在G标记或亚组中富集的KEGG术语包括:“调节干细胞多能性的信号通路”、“癌症中的转录失调”和“非小细胞肺癌”。
讨论
在本研究中，使用还原亚硫酸氢盐测序(RRBS)测定了15名pGGO患者肿瘤核心和组织及组织边缘的DNA甲基化模式。通过比较肿瘤组织与远端正常组织的甲基化评分，共筛选出4654个癌症特异性甲基化标志物。
根据肿瘤旁区域的变异模式，将这些标记进一步划分为S标记和G标记。S标记占肿瘤相关甲基化标记的86.2%，G标记占其他13.8%。S标记的甲基化评分在肿瘤组织边缘和肿瘤旁区域之间变化剧烈，G标记的甲基化评分逐渐变化。s标记相关基因在氧化石墨烯中富集，这与癌症的特征有关。研究者怀疑这些标记是癌细胞的指示物，癌细胞在肿瘤核心最富集，在肿瘤边缘仍然存在。然而，在组织学边缘以外的组织中，它们非常罕见，甚至不存在。就干细胞多能性和癌症转录失调而言，氧化石墨烯中富含g标记相关基因。这些基因在促进肿瘤生长中起关键作用。
当前越来越多的证据支持场癌理论，证实组织学上正常的癌前病变存在累积的遗传和表观遗传改变。本次研究结果也增加了pGGO领域的证据。
从遗传学上讲，在两名患者中最接近组织学正常组织的P5癌组织中发现相同驱动突变。这一结果与先前的一项研究一致，该研究表明，在21例EGFR突变腺癌患者中，有9例(43%)在正常呼吸道上皮中检测到与肿瘤相同的EGFR突变。在表观遗传上，P5和PN的大部分S和G标记甲基化差异显著(p<0.05)。因此，病理学家的主观组织学检查可能不足以确定癌变组织和癌前组织的根治性切除。分子病理学可能有助于更敏感和准确地定义手术切缘，从而影响术后复发和预后。
近年来，GGO的切除范围从肺叶切除术逐渐缩小到节段切除术，其疗效和安全性相当。一项前瞻性病理检查研究推荐的安全范围为20 mm。回顾性队列研究发现，切缘距离与生存有关。大于9 mm的手术切缘有较长的无复发生存期(RFS)，大于11 mm的手术切缘有较长的总生存期。在本研究中，P10、P15、P20和PN的甲基化状态没有显著差异。P10及以后的基因改变也没有被发现。然而，在P5和内部发现了遗传和甲基化改变。因此，可认为手术切除至少10毫米的宏观边缘足以去除异常DNA甲基化的癌前组织。
由于浸润性肺腺癌表现为pGGO生长缓慢，逐渐侵入周围正常组织并改变肿瘤微环境，因此有理由认为，癌前甲基化改变的情况有助于理解肿瘤进展的早期事件。pGGO是初步研究肿瘤侵袭及肿瘤邻近癌前区域的理想样本。
结论
在当前研究中，研究者证实了肿瘤、肿瘤组织学边缘和癌旁组织的DNA甲基化模式。观察到这些标记的两种DNA甲基化水平变化模式，并将其分类为S和G标记，聚集在不同的生物学途径上。
并且研究者还认为手术切除不小于10毫米的宏观边缘足以去除异常DNA甲基化的癌前组织。将表观遗传特征纳入手术切缘分析可能对手术切缘残余癌细胞和癌前细胞产生更敏感和准确的评估。
参考文献
Jia Z, Wang Y, Xue J, et al. DNA methylation patterns at and beyond the histological margin of early-stage invasive lung adenocarcinoma radiologically manifested as pure ground-glass opacity. Clin Epigenetics. 2021;13(1):153. Published 2021 Aug 19. doi:10.1186/s13148-021-01140-3
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