May
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大家好呀，今天分享的文章的主题为分析非小细胞肺癌（NSCLC）中免疫细胞丰度、免疫细胞之间距离和免疫细胞和肿瘤之间距离对预后的影响，全面描述非小细胞肺癌（NSCLC）的突变和临床病理背景下的空间免疫表型。文章思路清晰，于近期发表在《European Journal of Cancer》（IF =10）上，让我们来一起学习一下吧！
01
摘要
Part One
肿瘤微环境中的免疫细胞与预后和治疗反应有关。本文目的是全面描述NSCLC的突变和临床病理背景下的空间免疫表型。建立了多重荧光成像管道，以在359例NSCLC病例中对13个免疫细胞亚群进行空间定量：CD 4效应细胞（CD 4-Eff）、CD 4调节细胞（CD 4-Treg）、CD 8效应细胞（CD 8-Eff）、CD 8调节细胞（CD 8-Treg）、B细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、M1巨噬细胞（M1）、CD 163+骨髓细胞（CD 163）、M2巨噬细胞（M2）、未成熟树突状细胞（iDC）、成熟树突状细胞（mDC）和树突状细胞（mDC）以及浆细胞样树突状细胞（pDCs）。
02
研究结果
Part Two
1
NSCLC 空间表型免疫细胞的管道
建立了一个高通量的工作流程，其中包括:
T 和 B 淋巴细胞，自然杀伤(NK)细胞，巨噬细胞和树突状细胞亚群的组织切片多色荧光（mIF）染色 ;
多光谱扫描;
由专家病理学家和基于机器学习的组织和细胞分割的图像管理;
仔细的数据管理和标记信号的阈值化，随后的免疫细胞表型分型;
基于标记表达和细胞分割的空间定量。（图1A）
图1：在NSCLC中形成免疫细胞空间表型的管道
对359例NSCLC进行管道处理，经过去除不良样本剩余300个进行后续的分析。将每个免疫面板中不同免疫标记物的表达结合起来，将每个细胞分配到13种免疫细胞亚型中的一种，包括T和B淋巴细胞、巨噬细胞和髓系细胞、NK细胞、自然杀伤T细胞（NKT）和树突状细胞（DCs）。（图1B）
2
NSCLC的免疫景观
为了研究肿瘤和肿瘤基质中免疫细胞分布情况，比较了13种免疫细胞的浸润比例，并计算免疫细胞之间的相关性。
图2：细胞密度和相关矩阵
图2A：相对肿瘤而言，CD4 Eff是在肿瘤基质中最为丰富的免疫细胞；相反，iDC、mDC和NK细胞在肿瘤中较为丰富，但是富集量较小。腺癌（AC）和鳞癌（SCC）的免疫环境只有微小差异，经多次检测调整后无显著差异。
图2B：通常高淋巴细胞浸润伴随着M1巨噬细胞的丰度，而M2巨噬细胞仅与肿瘤基质中的CD4 Eff和CD8 Eff细胞相关。肿瘤基质中，pDC的丰度与B 细胞的丰度之间有意想不到的联系。
3
免疫细胞浸润、临床相关因素和存活率
分析了基质和肿瘤中免疫细胞浸润与年龄、性别、吸烟状况和分期之间的关系，在调整多重测试后，没有显著相关性。作者又分析免疫浸润比例和生存之间的相关性，在多变量COX回归分析中（独立于分期、年龄和体能状态），所有注释的免疫细胞的整体的高密度与较长的存活期相关。随后，作者分析了每个注释的免疫细胞亚群的预后影响，在NSCLC 队列中，观察到 CD4 Eff，CD4 Treg，CD8 Eff，CD8 Treg，B 细胞，M1和pDC与更长的生存期呈正相关，在腺癌和鳞状细胞癌亚组中也观察到大多数相关性。调整协变量逐步Cox回归模型确定了CD4 Eff和CD8 Treg作为最重要的积极的预后参数。结果表明，许多免疫细胞亚群对传统的临床参数有良好的预后影响，而且这种影响并不局限于细胞毒性T淋巴细胞。
4
肿瘤和免疫细胞的空间分析
众所周知，肿瘤的免疫过程和免疫细胞的数量相关，测序技术的不断发展，不仅可以观察到单个细胞的表达情况，也可以观察到细胞的空间位置。免疫细胞的数量对肿瘤的治疗很关键，但同时免疫细胞和肿瘤细胞之间的距离也很重要。因此作者通过最近邻分析来测量了肿瘤和免疫细胞之间的距离。NK-和NKT-细胞由于其丰度较低，无法进行分析。
与肿瘤细胞相关的不同免疫细胞亚群的分布显示出两种主要模式，1. 效应CD4, CD8 Eff， M1巨噬细胞和髓样聚合在肿瘤细胞附近，相比之下，其他免疫细胞在该区域分布更均匀，与肿瘤细胞的平均距离更长；2.成熟的树突状细胞表现出相反的形态，且主要位于远处。
作者又分析了肿瘤细胞和免疫细胞之间的平均距离对总生存期的影响，当分析平均距离时，同样的免疫细胞也显示出与基于密度的存活率相关，这可以解释为距离与密度有关的事实。成熟的树突状细胞是个例外，这些细胞与肿瘤细胞的距离越远，存活时间越长。在调整临床参数后，仅CD8Eff与肿瘤细胞的距离与生存存在显著联系。（图3）
图3：肿瘤细胞和免疫细胞之间的距离与患者生存关系
当对免疫细胞彼此的距离进行分析,发现距离相近的淋巴细胞亚群(CD4 Eff、CD4 Treg 、CD8 Eff, CD8 Treg和B细胞)与长生存期相关。反观巨噬细胞和树突状细胞亚群，这种关系并不清楚。当调整主要的临床指标时，只有 CD8 Treg 和 B 细胞之间的接近表明与更长的总生存期有关。
接下来，作者又将距离和免疫细胞的丰度相结合来分析和生存之间的相关性，密度与距离的比率增加了影响未调整和调整的存活率。然而，一个显著的例外是淋巴细胞亚群与CD8 Treg细胞的关系。当考虑到与CD8 Treg细胞的距离时，密度与距离的比率增加时淋巴细胞的有利预后影响减弱。（图4）
图4：免疫细胞密度/距离与生存之间的关系
为了评估距离和密度与生存的相互关系，作者进行了多变量逐步COX回归分析，包括所有免疫细胞密度和所有淋巴细胞亚群的距离以及年龄、分期和状态。再次，低阶段和良好的表现状态显示了对生存的强烈影响。独立地，高密度的 CD163和 M1巨噬细胞对预后有利。然而，不仅纯密度重要，而且免疫细胞之间的距离也表现出独立的预后影响。当CD8 Treg和B细胞,B细胞和CD4 Treg细胞距离更近的时候，生存时间更长。此外，CD8 Eff细胞与肿瘤细胞越接近，患者的生存时间就越长，特别是所有选定参数的HR最低时。M1和M2之间距离更近时，生存更差。（图5）
图5：免疫细胞密度和距离的逐步多变量 Cox 回归
总之，这些结果表明，免疫细胞的密度和位置都具有预后信息，并且在生物标志物研究中应考虑这两个特征。
03
文章小结
Part Three
本文逻辑清晰，逐步分析得分析揭示了和预后相关的信息。首先本文开发了一个管道，这个管道可以量化免疫细胞以及免疫细胞空间位置，并设计标记基因来识别不同类型的免疫细胞。本文最大的亮点在于研究肿瘤和肿瘤基质的免疫细胞的丰度，以及丰度对癌症预后的影响，免疫细胞和肿瘤之间的距离以及距离对预后的影响，并结合两者——免疫细胞丰度和距离来预测和预后的而影响，从两个角度以及将两个角度结合更具有说服力，并在其它癌症中进行研究。思路清晰，值得我们学习！！
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