scDbs,“看见”不可见的P53抑癌基因/RAS致癌基因突变靶点

Vivian 微 lin 肺癌前沿
            

双特异性抗体在肿瘤免疫的应用进展掠影

Targeting cancer with bispecific antibodies.

J.Weidanz, Science 2021.

不同于高度个性化的细胞疗法，基于治疗抗体蛋白质的免疫疗法提供了通用或“现成”免疫治疗药物。例如T细胞“链接器”Tcell engager双特异性抗体(CD3 BsAbs)触发T细胞上的CD3表面受体信号，也结合肿瘤细胞上的第二目标蛋白，靶向和激活细胞毒性T细胞，以消除一个癌细胞。但是这种方法有挑战，包括确定通用的选择性靶点和蛋白质工程来重定向T细胞杀死肿瘤细胞。Hsiue等人(Emily Han-Chung Hsiue et al. Science 2021;371:eabc8697)和Douglass等人(Jacqueline Douglass et al. Sci. Immunol. 2021;6:eabd5515)的一项研究描述了识别突变相关ne- oantigens (MANAs)的CD3 BSAbs的发展。此外。Paul等人(Suman Paul et al., Sci Transl Med 2021;13:eabd3595)描述了一种CD3BSAb，它使用T细胞受体(TCR)特异性抗体选择性地消除T细胞恶性肿瘤，同时限制正常T细胞的消耗。在未来，这些免疫治疗药物可以用于治疗具有特定突变的各种癌症。

肿瘤抗原分为肿瘤相关抗原(TAAs)和肿瘤特异性抗原(TSAs)， TAAs可被肿瘤细胞异常表达，但不特异于肿瘤细胞。因为正常组织也表达TAAs，尽管水平较低，靶向TAAs的免疫疗法的靶向性肿瘤毒性值得关注。相反，TSA（肿瘤特异性抗原）只在癌细胞中表达。MANAs( mutation associated neoantigens)是TSA（肿瘤特异性抗原）的一个亚类，源于癌症基因中常见热点突变的转录表达。二代测序技术结合蛋白组学和信息技术工具加速了MANAs的发现，特别关注那些来自肿瘤驱动基因(突变时给细胞选择性生长优势)的可能靶向新抗原。如肿瘤抑制基因TP53编码p53)和RAS致癌基因(KRAS,HRAS和NRAS).

MANAs和其他细胞蛋白一样，被蛋白酶体加工，产生的肽被抗原加工(TAP1-TAP2)复合物的异二聚体运输到内质网(ER)的内质网腔内，然后被ER氨基肽酶剪切成8到10个氨基酸肽。这些突变肽(新肽)被加载到经典的人类白细胞抗原(HLA)I类分子上，这些分子作为新抗原(pHLA)在细胞表面呈现MANAs。寻找与HLA分子结合的新多肽可以通过使用软件来辅助。Hsiue等人Douglass等人提供了发现和量化新抗原的路线图。两个研究团队分别采用计算机建模方法预测肿瘤中常见突变蛋白 p53R175H、KRASGI2V、HRASGI2V、NRASGI2V、NRAS961L和HRAS961与不同HLA I类等位基因的结合。例如，突变肽D53R175H结合HLA-A2, KRASGI2V结合HLA-A3, NRASOI结合HLA-AI。为了证实硅预测，两个团队都使用了高灵敏度质谱(MS)方法[mana -选择性反应监测(SRM)]来分析HLA结合肽。Hsiue等人平均估计，人类多发骨髓瘤细胞系每个细胞仅表达2.4个p53875H/HLA-A2。Douglass等研究表明，KRASGI2V的9-ano - 10-氨基酸长肽均由HLA-A3加工并呈现。然而，只有10个氨基酸长的KRASGI2V肽在人肺乳头状病毒腺癌和胰管腺癌细胞株HLA-A3上分别有9个拷贝和3个拷贝。虽然过继T细胞疗法已被用于靶向致癌基因和抑癌基因(6)，但这些研究结果直接证实了MANApHLAs存在于人类癌细胞中，但数量非常少。

TCR-mimic(TCRm)抗体识别来自细胞内蛋白的pHLA(7)。含有TCRm的CD3双特异性先前已在体外实验中显示出能介导人结直肠腺癌细胞的T细胞毒性{8，9) .Hsiue e al和道格拉斯等使用噬菌体展示技术从人类抗体库中筛选能够特定靶向于他们感兴趣的MANA pHLA的TCRm（ 。两个研究小组都应用单链双特异性抗体的format，来合成各自需要的CD3 BsAb，该双特异性抗体包括针对MANApHLA的单链TCRm抗体片段(Fv)与scFv-CD3 抗体融合。CD3scFv部分结合CD3，并在靶向表达MANA pHLA抗原的癌细胞时激活多克隆T细胞反应

含有共同TP53突变R175H的突变肽可以在肿瘤细胞表面与HLA-A*02:01形成复合体。H2-scDb是一种双特异性抗体，它与p53R175H肽- hla复合物和T细胞受体复合物结合，激活T细胞杀死肿瘤细胞。

Structural basis of H2 specificity and identification of putative cross-reactive peptides. (A) Detailed interactions of the p53R175H peptide with HLA-A*02:01. The peptide (green) and the side chains (gray) of interacting residues of HLA-A*02:01 are represented as sticks. Hydrogen bonds are shown as dashed lines. (B) Perpendicular view of the p53R175H peptide binding cleft. (C) C terminus of the peptide (amino acids Val173 to Cys176) with Arg174 and His175 surrounded by the interacting residues of CDR-H1 (magenta), -H2 (purple), -H3 (orange), and -L3 (yellow) shown as sticks. Hydrogen bonds are shown as dashed lines.

Diabodies see the unseeable "看见“

RAS致癌基因突变在各种癌症中都很常见，控制着它们的生长和生存。由于低表面表达，用抗体靶向突变的RAS蛋白一直不成功，即使靶向通过HLA呈现在癌细胞表面的突变RAS多肽。Douglass等人利用噬菌体展示产生了特异性于RAS肽- hla复合物的单链可变片段(scFvs)。作者测试了各种双特异性T细胞抗体，发现单链抗体(scDbs)将上述单链抗体与抗cd3单链抗体结合，能够诱导T细胞激活，并随后杀死表达突变RAS多肽- hla复合物的肿瘤细胞。这种scDb方法为基于抗体的治疗打开了大门，以对抗癌细胞表面极低水平表达的突变新抗原。

Jacqueline Douglass et al. Bispecific antibodies targeting mutant RAS neoantigensSci. Immunol. 2021;6:eabd5515

Hsiue等人和Douglass等人描述了具有高敏感性的scDbs，它可以在体外激活T细胞来溶解表达小于10个新抗原pHLAs的人骨髓瘤细胞和肺乳头状腺癌细胞。此外,Hsiue研究团队结果表明，免疫缺陷小鼠移植人T细胞后，在H2-scDb处理后，平均每个细胞表达2.4个p53R175H/HLA-A2的人多发性骨髓瘤细胞系的生长受到抑制。这些研究为CD3 BsAbs通过靶向那些以极低的密度表达在肿瘤细胞表面的细胞内抗原靶点，以激活多功能性T细胞反应来消除肿瘤细胞提供了第一个证据，此前这些抗原靶点被认为是nondurggable的。到目前为止，已经有超过100种不同的CD3 BsAb格式被开发用于治疗(10)。Hsiue等人和Douglass等人创建了多种CD3 BsAbs格式，包括使用不同的CD3抗体，以确定最佳的scDb。与其他双特异性格式相比，scDb的分子量小、紧凑和刚性特性可能是其抗肿瘤活性增强的原因。当涉及到低密度表达的肿瘤靶抗原时，如Hsiue等人和Douglass等人所描述的，情况尤其如此。也许scDb更强的抗肿瘤活性与在肿瘤细胞和T细胞之间建立优化的免疫突触有关。CD3抗体或其结合表位的亲和力也是重要的影响因素。这些发现可能会促进靶向MANA pHLA和癌细胞上其他TAAs和TSAs的scDb CD3 BsAbs的快速发展。

Paul等人描述了一种使用scDb分子来清除T细胞恶性肿瘤(T细胞白血病和淋巴瘤)，同时保留健康T细胞的方法。为了建立概念的证明，作者利用了之前鉴定的TCR链可变区域TRBV5-5和TRBV12的两个抗体，这是30个可能的TRBV家族成员中的两个，它们形成了T细胞表达的功能性TCR。因为T细胞恶性肿瘤是克隆性的，并且在其表面只表达一个TRBV家族成员，靶向单一TRBV类型是选择性治疗CD3 BsAbs的理想TAA。Paul等人的研究表明，scDb由抗TRBV5-5或TRBV12的抗体组成，并与CD3抗体融合在一起，可以选择性地清除小鼠模型中表达TRBV5-5或TRBV12的恶性人类T细胞，同时保留大多数不表达靶向TRBV的健康人类T细胞。

Suman Paul et al., TCR β chain–directed bispecific antibodies for the treatment of T cell cancersSci Transl Med 2021;13:eabd3595

虽然Hsuie等人、Douglass等人、Paul等人的研究有望将scDbs推向临床，但在充分实现治疗效果之前，还有其他因素需要考虑。scDbs分子量相对较小，在人类和小鼠的血液中迅速清除，这可能使我们有必要通过植入泵持续注入scDb药物以达到治疗效果。在scDb分子上添加一个IgG (Fc)结构域预计会增加其血浆半衰期，然而，添加一个Fc结构域也会产生一个更大的分子，在空间上阻碍表位结合，导致抗肿瘤效力降低。虽然进一步鉴定共同的MANA pHLA将扩大实体肿瘤中CD3 BsAbs的druggable靶点，经典HLA I类的多态性限制了这些药物的靶向对象。为了扩大人群覆盖范围，另一种选择可能是寻找非经典HLA(即HLA- e和HLA- g)的manaderid肽。与经典HLA不同，HLA- e和HLAG本质上是单型的，它们的活性在癌细胞上是上调的。MANAs中是否存在HLA-E和HLA-G肽可能值得研究。与肿瘤微环境相关的潜在问题可能会限制CD3BSAbs的有效性，包括scDb对血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤的疗效。例如，在观察到T细胞激活受限的情况下，正在寻求与激动剂抗体联合激活共刺激受体，如CD137(11)。血液和实体肿瘤都能逃避免疫细胞的反应，因为抑制性免疫检查点会对CD3 BsAbs激活T细胞产生负面影响。潜在的解决方案包括与已知的免疫检查点抑制剂联合，激活T细胞的同时恢复期杀伤功能 (12)。此外，一些实体瘤缺乏T细胞浸润，BsAbs与溶瘤病毒和癌症疫苗的结合正在被评估(10,13)。Hsiue等人、Douglass等人和Paul等人的研究为实现off-the-shelf基于蛋白质的免疫疗法提供了一个潜在的途径，用于治疗特定TAAs或以MANAs表达的肿瘤。然而，在实现这一雄心勃勃的目标之前，还需要更多的工作来解决这三项研究和其他研究提出的问题。