CLIP1-LTK融合是非小细胞肺癌的一个驱动致癌基因

编译：广东省人民医院 广东省肺癌研究所 康劲

摘要：肺癌是最具侵袭性的肿瘤之一。由驱动基因分层的靶向治疗显著改善了非小细胞肺癌（NSCLC）患者的治疗效果。然而，在25%-40%的肺腺癌（NSCLC最常见的组织学亚型）病人中未发现驱动基因。在本文，我们在多机构基因组筛查平台(LC-SCRUM-Asia, UMIN000036871) 中使用全转录组测序鉴定了一种新的CLIP1和LTK融合转录本。CLIP1–LTK融合存在于0.4%的NSCLC中，并且与其他已知致癌基因相互排斥。我们发现CLIP1–LTK融合蛋白的激酶活性是组成型激活的，并且具有转化潜力。ALK抑制剂劳拉替尼治疗表达CLIP1–LTK的Ba/F3细胞，能抑制CLIP1–LTK激酶活性，抑制增殖并诱导凋亡。1例携带CLIP1–LTK融合基因的非小细胞肺癌患者对劳拉替尼治疗表现出良好的临床反应。据我们所知，这是首次描述LTK基因异常与癌症的致癌活性关系。这些结果确定CLIP1–LTK融合是非小细胞肺癌的一个靶点，可以用劳拉替尼治疗。





前言
致癌基因的发现揭示了非小细胞肺癌的发病机制。综合分子分析表明，在76%的肺腺癌样本中，体细胞驱动基因可在受体酪氨酸激酶RAS-RAF通路中被识别。这些包括体细胞突变（例如，KRAS、EGFR和BRAF突变）和融合（例如，ROS1、ALK和RET）。此外，基于转录组测序的方法确定了NSCLC中其他可作用的致癌驱动基因，如CD74-NRG1融合。相应激酶抑制剂的开发改变了治疗策略，提高了具有靶向驱动基因的患者的生存率。然而，大部分晚期非小细胞肺癌患者，其肿瘤缺乏这种已知的驱动基因，尚未开发出靶向疗法。2013年，我们建立了一个多机构肺癌基因组筛查平台（LC-SCRUM-Asia），以识别具有驱动基因的肺癌，并在临床上开发分子靶向疗法。在这里，我们应用这个平台来寻找新的驱动基因。




CLIP1-LTK融合的识别
为了识别新的致癌基因融合，我们开始对LC-SCRUM-Asia平台中已知驱动基因阴性的NSCLC样本进行全转录组测序（WTS）。在2020年10月至2020年12月期间分析的75份样本中（扩展数据表1），我们在一名患者（患者1）中识别到染色体12q24上的CLIP1和染色体15q15上的LTK的框内融合转录本（图1a）。LTK和ALK构成受体酪氨酸激酶的ALK/LTK亚家族，而CLIP1是微管正端追踪蛋白家族的成员。预测CLIP1-LTK融合蛋白在完整LTK激酶结构域的CLIP1上游含有多个卷曲线圈结构域（图1b）。为了证实编码融合蛋白的转录本存在于该个体的肿瘤中，我们使用两组引物进行PCR和逆转录（RT-PCR）去检测锁骨上淋巴结和肝脏这两个转移部位组织中的扩增子（图1c）。Sanger测序验证了表达转录本中CLIP1外显子16与LTK外显子11的融合序列（扩展数据图1）。此外，我们进行了分离荧光原位杂交（FISH）分析，以进一步验证该个体的LTK重排。这些探针的杂交显示非肿瘤细胞中的橙色（5’）与绿色（3’）的融合信号（扩展数据图2，左图）。然而，82%的评分肿瘤细胞显示至少一个纯绿色（3’）信号，包括激酶结构域，这表明存在LTK重排（扩展数据图2，右图）。肿瘤细胞缺乏橙色信号（5’）可能表明该染色体区域缺失。

接下来，为了确定CLIP1-LTK融合在肺癌中多普遍，我们使用上述的RT-PCR检测了来自LC-SCRUM-Asia平台的不同类型肺癌患者的572个肿瘤样本，不管驱动基因状态。这融合在检测的30例小细胞肺癌中均为阴性。在我们分析的542份NSCLC样本中，有两份CLIP1-LTK融合转录本呈阳性（NSCLC为0.4%）（图1e中的患者2和3）。总的来说，CLIP1-LTK融合阳性的三个肿瘤（来自患者1-3的肿瘤）的其他已知的驱动基因检测呈阴性，这表明CLIP1-LTK融合与其他已知的驱动基因是相互排斥的。我们还进行了ALK免疫组化分析，已被批准作为检测ALK融合的免疫组化检测方法显示这3个肿瘤ALK融合均为阴性。这三个具有CLIP1-LTK融合的肿瘤在组织学上均被分类为腺癌（扩展数据图3，扩展数据表2）。

CLIP1-LTK的转化潜能

据报道，卷曲螺旋结构域促进蛋白质二聚化，我们研究CLIP1-LTK蛋白是否可以形成可能激活LTK激酶的二聚体。为此，我们分别瞬时转染携带CLIP1-LTK、野生型（WT）LTK或模拟对照的NIH3T3细胞，并使用检测酪氨酸672磷酸化LTK的抗体检测细胞提取物的免疫印迹。我们在表达CLIP1-LTK细胞中检测到强烈的磷酸化，而当细胞转染WT LTK时，磷酸化则弱得多（图2a）。接下来，我们测试了CLIP1-LTK蛋白是否能够转化通常用于分析转化潜能的小鼠系，即NIH3T3成纤维细胞和Ba/F3 pro-B系。为此，我们用MIGR1逆转录病毒构建物转导了两个株系，以实现人类CLIP1、LTK、CLIP-CLTK和GFP或空转病毒的高效表达。作为另一个对照，我们用含有K1140M突变（CLIP1-LTK（K1140M））的CLIP1-LTK转导细胞，该突变对应于EML4-ALK（K589M），并使融合蛋白激酶死亡。对GFP阳性细胞进行分类，并用磷酸化LTK抗体对细胞提取物进行免疫印迹分析，结果显示在表达CLIP1-LTK（NIH3T3-CLIP1-LTK或Ba/F3-CLIP1-LTK）的NIH3T3或Ba/F3细胞中有强条带，但在空转染细胞或表达LTK（NIH3T3-LTK或Ba/F3-LTK）或CLIP1-LTK（K1140M）的细胞中没有可见条带（NIH3T3-CLIP1-LTK（K1140M）或Ba/F3-CLIP1-LTK（K1140M））（

扩展数据图4

）。这些结果证实了CLIP1-LTK在稳定转导的细胞系中被组成性激活。转导的NIH3T3细胞、NIH3T3-LTK和NIH3T3-CLIP1-LTK的流式细胞试验显示，LTK而不是CLIP1-LTK，在细胞表面表达（扩展数据图5a），而LTK和CLIP1-LTK均在细胞质中检测到（扩展数据图5b）。这些结果表明CLIP1-LTK位于细胞质中，因为它缺乏LTK的跨膜结构域。

进一步的分析表明，表达CLIP1（NIH3T3-CLIP1 cells）的NIH3T3细胞、NIH3T3-LTK细胞和空转导细胞受到接触抑制，表现出正常的鹅卵石样形态，而NIH3T3-CLIP1-LTK细胞表现出圆形形态（图2b）和缺乏接触抑制（扩展数据图6a）。该分析还显示NIH3T3-CLIP1-LTK（K1140M）细胞表型类似空转导细胞，并表现出正常接触抑制。此外，软琼脂中的菌落形成试验显示，与空转导的NIH3T3-CLIP1或NIH3T3-LTK细胞相比，在生长两周后，NIH3T3-CLIP1-CLTK细胞的菌落显著增大（扩展数据图6b）。事实上，NIH3T3-CLIP1-LTK细胞克隆群的直径大于表达EGFR（L858R）的阳性对照NIH3T3细胞直径，后者具有转化活性（图2c）。最后，正如预期的那样，NIH3T3-CLIP1-LTK（K1140M）细胞没有表现出锚定非依赖性生长（图2c）

Ba/F3细胞需要白细胞介素-3（IL-3）来生长，但致癌激酶的表达使其与IL-3无关。事实上，在没有WEHI培养基作为IL-3来源的情况下，AKT和ERK在Ba/F3-CLIP1-CLTK细胞中保持激活，但在空转导的Ba/F3细胞或用CLIP1、LTK或CLIP1-LTK（K1140M）转导的Ba/F3细胞中不激活（图2d）。与此观察结果一致，与其他Ba/F3稳定细胞不同，Ba/F3-CLIP1-LTK细胞显示IL-3非依赖性生长（图2e），表明CLIP1-LTK具有转化活性。

为了进一步确认体内CLIP1-LTK的转化活性，我们将用空病毒、CLIP1、LTK、CLIP1-LTK或CLIP1-LTK（K1140M）转导的NIH3T3细胞皮下注射到裸鼠的侧翼。仅在注射NIH3T3-CLIP1-LTK细胞的裸鼠中检测到肿瘤（图2f）。值得注意的是，在注射NIH3T3-CLIP1-CLTK（K1140M）细胞的小鼠中未观察到肿瘤。总之，这些结果支持以下结论：CLIP1-LTK融合依赖于其自身激酶活性实现致癌转化。





劳拉替尼抑制CLIP1-LTK活性

由于LTK和ALK在各自的激酶结构域中具有近80%的相同性，我们假设开发为ALK酪氨酸激酶抑制剂的化合物可能可以抑制CLIP1-LTK融合蛋白的组成性激酶活性。为了验证这一假设，我们用不同浓度的七种美国食品和药物管理局批准或研究的酪氨酸激酶抑制剂（已知可抑制ALK）处理瞬时转染CLIP1-LTK表达结构的NIH3T3细胞。然后，我们从这些细胞的提取物中进行免疫印迹实验，并用磷酸化LTK抗体对其进行检测。在所测试的抑制剂中，劳拉替尼是最有效的，在10 nM时几乎完全阻断CLIP1- LTK磷酸化（图3a）。根据使用WT ALK的生化激酶测试结果，劳拉替尼是第三代ALK/ROS1抑制剂，其半最大抑制浓度（IC50）低于0.07 nM。与这些观察结果一致，在使用Ba/F3-CLIP1-LTK细胞进行的细胞活力测定中，劳拉替尼的IC50为1.1 nM，而使用其他ALK抑制剂获得的值在10μm范围内（图3b）。相比之下，奥希替尼不如ALK抑制剂有效，IC50值高于100 nM。当Ba/F3-CLIP1-LTK细胞在含有IL-3的WEHI培养基中培养时，劳拉替尼不抑制细胞活力，排除非特异性毒性的可能性（扩展数据图7）。此外，劳拉替尼治疗可抑制NIH3T3-CLIP1-LTK细胞在软琼脂中的锚定非依赖性生长（扩展数据图8），表明劳拉替尼可能对CLIP1-LTK诱导的肿瘤有效。

先前的报告表明LTK激活AKT和ERK。因此，我们测试了劳拉替尼抑制CLIP1-LTK激酶活性是否会影响细胞增殖或凋亡的下游信号。为此，我们用不同浓度的劳拉替尼处理Ba/F3-CLIP1-LTK细胞24小时，然后制备细胞裂解物，用指示抗体进行免疫印迹（图3c）。该分析显示，与未经治疗的对照组相比，CLIP1-LTK、AKT和ERK的磷酸化降低，以及在低至10nM的劳拉替尼浓度下诱导非磷酸化、稳定形式的BIM和全长PARP的裂解（也指示凋亡）。这些结果表明，激活CLIP1-LTK下游的AKT和ERK可促进增殖和细胞存活，而抑制CLIP1-LTK激酶活性可诱导细胞凋亡。

为了进一步评估劳拉替尼对CLIP1-LTK肿瘤的抑制能力，我们将NIH3T3-CLIP1-LTK细胞皮下注射到裸鼠的侧翼，当肿瘤体积达到约100 mm3时，用劳拉替尼或溶媒对照治疗2周。与细胞活力测定一致，劳拉替尼在动物上显著抑制肿瘤生长（图3d）。

CLIP1-LTK作为治疗靶点

上述患者1（扩展数据表2）接受了四个周期的卡铂、培美曲塞和派姆单抗的一线治疗，导致肿瘤缩小。然而，在随后使用培美曲塞加派姆单抗进行维持治疗后，计算机断层扫描（CT）图像显示疾病进展迅速，原发肿瘤和多发转移瘤（包括肝转移瘤）均扩大（图3e）。患者肿瘤cDNA的WTS和Sanger测序显示CLIP1-LTK融合（图1a，c，扩展数据图1），LTK重排通过FISH确认（扩展数据图2）。患者充分知情劳拉替尼治疗的潜在获益和风险、我们临床前的研究结果，然后同意接受LTK靶向治疗。在日本国家癌症中心医院东部审查委员会批准非标签使用后，劳拉替尼开始以每天一次100毫克的常规剂量服用。患者两个月和五个月的随访CT图像显示原发肿瘤和多发转移瘤快速、实质性缩小（图3e）。此外，如全身正电子发射断层扫描（PET）图像所示，所有原发性和转移性肿瘤对劳拉替尼治疗均有反应（图3f）。这些结果表明，携带CLIP1-LTK融合基因的NSCLC患者可能是劳拉替尼治疗的候选者。

讨论

在这项研究中，我们在不含已知驱动基因的NSCLC患者中鉴定了CLIP1-LTK融合，并证明了CLIP1-LTK激酶是组成性激活的，并且具有致癌转化能力，可被劳拉替尼抑制。临床上，我们报告一例携带CLIP1-LTK融合蛋白的非小细胞肺癌患者对劳拉替尼表现出强烈的积极疗效。

为了鉴定新的致癌基因融合，我们使用了经LC-SCRUM-Asia平台分子分析确定的已知驱动基因阴性的队伍。此外，我们使用了基于RNA的靶向方法，该方法比DNA测序更准确，但有时会受到RNA质量和数量的限制，特别是当样本来自福尔马林固定的石蜡包埋组织时。然而，在LC-SCRUM-Asia平台，新鲜冷冻组织被提取进行分子分析，衍生的RNA样本具有足够的数量和质量，这些因素可能有助于成功鉴定CLIP1-LTK融合转录本作为NSCLC中的一种新驱动基因。

在我们的日本队列研究中，0.4%的NSCLC标本含有CLIP1-LTK融合。致癌融合如ALK、ROS1和RET只占肿瘤的一小部分，在非小细胞肺癌中不到5%，并且在不同种族和种族的人群中观察到它们的患病率相似。因此，我们预测全球每年有超过7500例NSCLC患者携带CLIP1-LTK融合。然而，由于我们研究中显示这种融合的个体数量较少，目前尚不清楚以CLIP1-LTK融合为标志的NSCLC是否会表现出独特的临床特征。使用 LC-SCRUM-Asia队列（n=1500）对CLIP1-LTK融合进行回顾性筛查，将提供更详细的患病率和临床病理特征信息。此外，还需要进一步努力确定该融合在其他种族或族裔群体中的流行程度。

据我们所知，这是首次报道癌症中LTK的功能性致癌作用。尽管癌症基因组图谱研究项目在甲状腺癌中发现了非复发性UACA-LTK融合，但这似乎是一种框架外融合，其致癌能力尚不清楚。然而，以前的报告表明LTK过度激活可诱导转化。此外，WT LTK在脑、胎盘和造血细胞中表达，如B细胞系，而CLIP1则广泛表达。CLIP1-LTK融合的转录由CLIP1启动子驱动，因此CLIP1-LTK蛋白可以在多种细胞类型中表达，包括肺泡细胞。由于通过CLIP1螺旋结构域的二聚作用，与CLIP1的融合也被预测可组成性激活LTK。这一观点得到了以下观察结果的支持：CLIP1也是多种癌症中受体酪氨酸激酶基因ALK、RET和ROS1的融合伴侣，如Spitz肿瘤、肾细胞癌和NSCLC。

在我们的研究中，三名患者含有CLIP1-LTK融合的肿瘤组织没有表现出其他已知的致癌基因。因此，在这些病例中，CLIP1-LTK可能是肺癌发生的唯一驱动因素。虽然目前还没有LTK特异性抑制剂，但我们评估了已知的ALK抑制剂，它们大多数在体外可抑制LTK激酶活性。在所测试的抑制剂中，劳拉替尼是最有效的，在Ba/F3-CLIP1-LTK细胞中的IC50为1.1 nM，与表达EML4-ALK的Ba/F3细胞中的IC50值相似。劳拉替尼成功治疗1号患者的事实证明，可以立即使用更大的CLIP1-LTK融合肺癌患者队列进行研究。事实上，我们正计划使用LC-SCRUM-Asia平台患者（n=5000）进行大规模前瞻性CLIP1-LTK筛查来回答这个问题。此外，我们的研究为开发更特异的LTK抑制剂提供了理论基础。

总之，我们确定CLIP1-LTK融合是NSCLC中的致癌驱动基因，并表明该融合蛋白可以被劳拉替尼抑制。分子靶向药物的紧急临床开发以及这种新驱动基因的常规筛查和临床验证是现在非常有必要的。


END
原文出处：Izumi,H., Matsumoto, S., Liu, J. et al. The CLIP1–LTK fusion is an oncogenic driverin non‐small‐cell lung cancer. Nature (2021).https://doi.org/10.1038/s41586-021-04135-5