肺癌中胃泌素释放肽受体的表达

编译：广东省肺癌研究所 陈旻星

摘要

胃泌素释放肽受体 (GRPRs)通过表皮生长因子受体激活有丝分裂原活化蛋白激酶信号（MAPK)通路。选取2004年到2008 年期间200例非小细胞肺癌以及38例小细胞肺癌病理组织，结合临床资料分析不同组织中GRPR的表达水平。结果：GRPR在非小细胞肺癌中的表达比小细胞肺癌更高；其中，腺癌以及晚期肺癌病例表达率更高。这是第一项在大型肺癌人群中进行的有关 GRPR 表达的研究。GRPR 在晚期腺癌病人中相对表达更高，可能成为该人群的一个新的治疗靶点。

前言

肺癌是全球癌症相关性死亡的主要恶性肿瘤，每年超过100万人死于肺癌。75%的肺癌患者在诊断时已是局部晚期或出现转移。尽管近年来肺癌的生物学行为研究取得了进展，肺癌患者的5年生存率仍低于15%；提高生存率需要新的治疗靶点。胃泌素释放肽 (GRP)是一种铃蟾肽样肽生长因子，由肺神经内分泌细胞表达，可以刺激胚胎肺发育和促进人类胎肺器官培养物的生长成熟。它可能参与生长失调和癌变。GRP 的作用主要通过与GRP受体(GRPR)结合而发挥作用。GRP-GRPR通过刺激表皮生长因子受体(EGFR)的前配体释放，来激活EGFR和MAPK下游通路。此外，EGFR 特异性酪氨酸激酶抑制剂可阻断 GRP 介导的丝裂原活化蛋白激酶，表明 GRP 主要通过 EGFR激活MAPK。最新研究已证实EGF 和 GRP 均能刺激非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞系增殖。另外, GRPR拮抗剂联合EGFR酪氨酸激酶抑制剂可以导致额外的细胞毒性作用。

  为了研究GRPR作为未来肺癌治疗靶点的可能性，本实验探究GRPR在小细胞肺癌以及非小细胞肺癌中的表达情况与对应的临床特征的关系。就我们所知，这个试验的样本量是目前分析有关肺癌与GRPR表达的研究中最大的。

图1：GRP/GRPR通过EGFR激活丝裂原活化蛋白激酶

方法

收集238例2004年至2008年间愉港市南大河联邦大学确诊的肺癌病理标本，其中腺癌(n=100)、鳞状细胞癌 (n=71)、大细胞癌 (n=29) 和小细胞癌 (n=38)。对标本进行脱蜡、阻断血清交叉反应等操作后，用抗体孵育样本、素辣根过氧化物酶标记等进行免疫组化染色，检测样本的GRPR表达情况。对200个非小细胞肺癌样本和38个小细胞肺癌样本进行双盲组织病理学评分。每张切片随机选取五个包含恶性细胞团的高倍视野，对GRPR染色百分比和染色强度进行评分（染色阳性细胞百分比评分：0分，着色细胞≤5%（阴性）；1分，着色细胞占5%~25%；2分，着色细胞占25%~50%；3分，着色细胞占50%~100%；染色程度评分：0分，基本未染色；1分，弱染色；2分，中等强度染色；3分，强染色）（图 2，A 到 D；表1）。评分完成后分别计算不同诊断组别的染色百分比以及染色强度的平均值，并结合肿瘤细胞类型、性别、肿瘤分期（NSCLC 病例中的 I-IV期和SCLC 病例中的局限性和广泛性病例）、吸烟状况和生存情况进行分析。GRPR 表达和临床病理变量的相关性使用Pearson卡方检验和Fisher精确检验进行分析。总生存率通过Kaplan-Meier方法计算，组间差异通过对数秩检验、Fisher精确检验进行验证。我们的研究终点为截至到死亡或最后一次医院随访日期的生存期长度。我们定义P<0.05为差异有统计学意义。

图2：不同级别的GRPR染色强度图例。

表1 不同肺癌细胞种类中的GRPR染色强度以及染色百分比。

结果

  肿瘤标本来自腺癌100例、鳞状细胞癌71例、大细胞癌癌29例和小细胞癌38例。其余临床数据总结在表2中。关于GRPR表达以及临床分期，I和II期NSCLC中GRPR阴性率(62.16%)相较于晚期肺癌（III 期为 34%，IV 期为32.35%，广泛期病变为 43.24%）更高；GRPR强阳性率在晚期病例（临床 III 期为9.43%，IV期为 6.9%，广泛期肺癌为5.4%）中更高。更强的表达与更高的临床分期显著相关（P=0.01)（图 3）。关于GRPR表达与细胞种类，NSCLC与SCLC总体表达率类似，而NSCLC的GRPR中高表达的占比相对更高（P=0.30；图4）。中度GRPR表达的占比在腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌分别为16%、11.26%和10.34%。强GRPR表达的在腺癌，鳞状细胞癌和大细胞癌中占比分别是10%、4.22%和6.89% (P=0.67)。腺癌病例有更强的GRPR表达（图5）。GRPR 表达的差异在男性和女性受试者之间无统计学意义（P=0.91；图 6）。关于GRPR表达与生存情况分析，GRPR阴性患者中位总生存时间为 8.97 个月（95% 置信区间：5.6-12.3月），GRPR 弱表达和中等表达患者中位总生存时间为11.50 个月（95%置信区间：3.6-19.3 个月）；强GRPR 表达者中位总生存时间为10.6 个月（95% 置信区间，0.4–20.7 个月）（P=0.77）。根据临床分期调整 Kaplan-Meier 曲线（图7)

表2：分类别患者数据

图3：临床分期与GRPR表达

图4：NSCLC与SCLC中不同GRPR表达强度所占百分比

图5：NSCLC中不同种类细胞GRPR表达强度所占百分比

图6：性别与GRPR表达强度的关系

图7：Kaplan-Meier生存曲线

讨论

GRPR通过EGFR激活MAPK通路；GRPR拮抗剂联合EGFR酪氨酸激酶抑制剂可对肿瘤细胞系有额外的细胞毒作用。合成胃泌素释放肽受体拮抗剂，例如RC3095，已被开发为抗癌候选物，并且在小鼠和人类肿瘤模型的体内和体外试验中均显示出抗肿瘤活性，产生持久的抗肿瘤效果。在25名晚期难治性实体肿瘤患者中进行的 RC-3095 I期试验，RC-3095表现出良好的耐受性。

胃泌素释放肽受体最初由Cuttitta等人分离。大多数既往研究报道高达70%的小细胞肺癌表达GRPR;GRPR在非小细胞肺癌中阳性率为 10% 到 20%。相反，我们的研究表明 NSCLC和SCLC中的GRPR表达率相似，分别为 62.51% 和 52.62% (P =0.30)。在NSCLC病例中，在非小细胞肺癌病例中，腺癌受试者GRPR表达率有高于其他非小细胞肺癌的趋势(68%,其中41.5%为弱表达，13.5%为中等表达，7.5%为强表达，P=0.67）。我们的研究缺乏有统计学意义的结论，但是 GRPR的上调模式可能预示GRPR成为肺癌辅助治疗的靶点，尤其是腺癌。

GRPR 表达与吸烟、性别之间的关联尚不明确。一些研究表明，在非吸烟者中，GRPR基因在女性中的阳性率高于男性，女性在接触烟草后GRPR基因会更早被激活。另一方面，有实验者指出GRP表达率随着烟草使用而增加。相对于非吸烟者，长期吸烟的无症状患者的支气管肺泡灌洗液中和尿液标本可检测出更高水平的GRP。同时，我们注意到男性和女性之间的 GRPR 表达没有差异，表明 GRPR 在肺癌患者中的表达与性别无关。

小细胞肺癌和非小细胞癌组织的支气管上皮和粘膜下腺上皮都有GRPR的表达。GRPR在肿瘤外组织的作用尚不明确。然而，Egloff 及其同事评估了224名肺癌患者和107名手术无癌对照组的正常支气管上皮中的GRPR mRNA水平，GRPR在非癌支气管上皮中的表达与肺癌显着相关，独立于年龄、性别或吸烟状况.Egloff等人的实验显示71%的肺癌病例的非肿瘤性支气管细胞表达GRPR，无癌样本中只有38%的病例的非肿瘤性支气管细胞表达GRPR，表明GRPR 在正常上皮黏膜中表达增加可能是肺癌形成的早期事件。

相比于Ⅰ期和Ⅱ期肺癌，GRPR在临床 III 期和 IV 期和广泛期SCLC的表达总百分比和表达染色强度更高。这些差异具有统计学意义（P =0.01)，并且独立于肿瘤细胞类型、性别和生存情况。GRPR在晚期肺癌病人中的高表达的影响和意义值得进一步研究，GRPR可能成为一种潜在治疗靶点。

据我们所知，这项研究是第一个在肺癌患者中研究GRPR的表达和分布与临床分期关系的实验。GRPR 表达在NSCLC和SCLC的表达相似。其中腺癌和晚期肺癌中GRPR的表达更强，表明GRPR可能是这个人群的潜在治疗靶点。GRPR通过增加EGFR前体的释放来影响EGFR通路，因此GRPR可能会加快EGFR突变肺癌患者的疾病进展。

参考文献：

Mattei J, Achcar RD, Cano CH, Macedo BR, MeurerL, Batlle BS, Groshong SD, Kulczynski JM, Roesler R, Dal Lago L, Brunetto AT, Schwartsmann G. Gastrin-releasing peptide receptor expression in lung cancer.Arch Pathol Lab Med. 2014 Jan;138(1):98-104.doi:10.5858/arpa.2012-0679-OA.PMID: 24377816.

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