【Cell】Passenger mutations不止搭顺风车！

在《PCAWG-1》中提到在超过2,500个泛癌种肿瘤组织中，91%的肿瘤都存在至少一个驱动基因，但仍有181例肿瘤没有找到任何已知的驱动基因。那是咋回事？这些肿瘤就如有神助？或许这篇文章会解答其一二；

在ICGC/TCGA的PCAWG泛癌种数据库中，找到了44 million SNVs，包括了数千个所认为的driver突变，其他都是对肿瘤生长无关紧要的passenger突变；但近来研究已逐步发现，这些假定的putative passenger突变同样可以起到促进或抑制肿瘤生长，称为“mini-drivers”或“deleterious passengers”；因此本文正是基于PCAWG多组学数据平台进一步分析这些passenger突变，看到底是不是简单地搭顺风车？

Molecular functional impact of putative passengers

首先对PCAWG中所有非编码区基因突变进行分子功能影响评分（FunSeq score）；FunSeq注释工具根据以下特征进行评分：物种间保守性，转录因子序列的扩增或中断，已知增强子-基因相互作用的中断以及基因调控或蛋白质相互作用网络中的中心性；于是对非编码区域中的所有突变评分后就发现下图：

极具特色的三峰入云，右峰代表高影响的驱动基因，左峰代表低影响的neutral passengers，而中峰则代表着本文的兴趣对象-具有中等影响的putative passengers！

假设这些计算出来所谓具有更高功能影响的passengers在肿瘤生长中无选择作用，那么他们对于整体的肿瘤突变负荷则毫无影响。但事实远非如此，在一部分肿瘤中，如肺腺癌、CNS髓母细胞瘤，这些high-impact的passengers数量越少，整体的肿瘤突变负荷越高，呈现出一个弱的负性选择！（红点代表该癌种两个变量具有显著关联性）

- 除了SNVs以外，队非驱动SV（结构变异）进行功能影响评分时，同样发现一部分癌种具有高影响的SV，而且SV与SNV的分布在不同癌种之间的分布截然不同，一部分肿瘤多有high impact passenger SNVs，而另一部分则多有high impact passenger SVs；

Putative Passenger Burden among Different Genomic Elements

在不同肿瘤相关基因集中，直观地比较passenger与driver中Loss of function突变（LOFs）的分布：

可以清晰看到，driver基因的LOFs在不同肿瘤相关基因集中都显著富集，例如DNA修复、免疫应答以及关键基因；相反，passenger基因LOFs都没有富集，相差就明显的就是DNA修复！

当计算肿瘤基因组中非编码区域SNVs的整体分子功能影响是十分困难的，但有一个例外就是TF结合位点（TFBSes）；当评估TFBSes中SNV的功能影响可清晰地根据其binding motif形成或破坏（gain- or loss-of-motif），如下图：

在绝大多数癌种中，大量的SNV形成gain-of-motif富集在PRRX2、GATA等转录因子；而SNV形成的loss-of-motif富集在SP1，EGR1，EP300等转录因子；这现象提示着在肿瘤突变过程中，通过特定的调控子系统，这些非编码区的SNVs发挥着不同的作用。

就比如putative passenger突变发生ETS这一转录因子的结合motif上，形成gain/loss-of-motif，进而影响下游基因的表达调控，如上图，上调TERT、BCL2基因表达，下调IGHM基因表达；

不仅是调控元件上的SNV，SV（大片段缺失或拷贝数增加）同样如此；当我们比较基因组元件上的germline与somatic SVs时，观察到somatic SVs更多集中在功能元件上；另外，两者都存在engulf多于partial；engulf指SV直接包括了整个元件，如下图：

Characterizing muational processes underlying putative passengers

Putative passengers的突变虽是随机却并非均匀分布，仔细比较在编码与非编码区域passengers的突变图谱，可见下图（肾癌）：

- 在编码区域，导致转录终止（premature stops）的突变谱不同癌种之间不尽相同；例如在肾癌（RCC）中T>A的频率远高于整体水平；

- 同样地，对于不同转录因子而言，其对应TFBSes突变谱也不同，例如肾癌中SP1 motif主要的是C>T以及C>A，而HDAC2、EWSR1则较为一致；

随后进一步比较高影响与低影响的putative passengers的突变标签，结果如下：

- 可以看到高、低影响的putative passengers的突变标签具有明显差异，尤其是胰腺癌中；

- Sig  (1, 6, 7, 19, 28, 35)较多分布于高影响 putative passengers；

- Sig  (20, 22, 27, 39) 则较多分布于低影响 putative passengers；

- 此外，MSI（微卫星不稳定）肿瘤的passengers功能影响明显高于MSS;

Subclonal architecture and mutational heterogeneity of putative passengers

当一个高影响的基因突变对于肿瘤是有利的，那么它会广泛分布在肿瘤细胞群体；反之，若一个高影响基因分布极少，那么它对肿瘤而言是有害突变；这样的现象最典型的就是driver基因，如下图：

- 在编码区域的高影响passengers更多发生在早期克隆，其多在抑癌基因以及细胞凋亡相关基因上；

- 相反，在DNA修复、肿瘤通路以及oncogene上的高影响passenger多发生晚期克隆；

- 在瘤内异质性方面，无论是编码区域还是非编码区域，高影响的passenger SNVs其瘤内异质性低于低影响的passenger SNVs，这个倒是跟我们的driver基因突变类似！

- 在driver突变中，若其突变位点发生在保守区域（更高的GERP评分），其VAF随着增高；

- 相反的是，对于非驱动基因的passenger突变，若若其突变位点发生在保守区域（更高的GERP评分），其VAF随着降低；这也说明这类发生在保守区域的passenger基因突变起着负性选择的作用；

而当我们计算平均每位患者肿瘤内passenger基因平均GERP分值（分值越高，越发生在保守区域），这一分值与患者预后相关性正如下图所示：

- 结合以上认识，这个结果就显得合情合理！若GERP分值越高，患者预后更好；即当该患者肿瘤内的passenger基因越常发生在保守区域，则在肿瘤发展过程中起到负性选择作用，所以肿瘤生长更受抑制，患者预后更好！

Categorizing putative passenger variants

根据目前的认识，将putative passenger突变进行全面分类，如下图：

- 值得注意的是，在肿瘤演化过程中，一个基因的功能影响并非必然与其自然选择挂钩；例如，具有高功能影响的突变可能是中性突变，因为它们改变基因表达或活性的方式与肿瘤适应性无关；同样，具有低分子功能影响的突变可能因其影响特定细胞系统而与自然选择密切相关；

Additive-Effects Model

在众多针对复杂疾病或性状的GWAS研究中，例如肥胖或精神分裂症，其背后的遗传机制难以解释，成为“遗传性缺失”现象（missing heritability），而近来发现这极有可能也就是众多低影响的基因变异累积作用；

- 假若我们将一个亚克隆生长速度作为这一肿瘤亚克隆的复杂性状看待，尤其是对于未发现驱动基因的肿瘤而言，亚克隆的生长速度就可能是由putative passenger基因累积作用！

于是根据上述理念，运用累积效应模型来计算所有突变的累积效应，如下图：

- 第一个模型（Ci）：将突变二分类为driver与passenger，毫无疑问driver的效应远高于passenger，但是将passenger纳入考虑，累积的效应则从~49.9%增加至~59.4%；

- 而第二模型（Cii）：将突变分为编码区域、promoters以及其他非编码区突变，可以看到主要效应仍来自编码区域的突变，但是promoters以及其他非编码区突变所贡献的累积突变仍然显著，其贡献的累积效应分别达~1.9%，~6.9%；

- 为了进一步分析putative passengers的累积效应作用，在无驱动基因突变的肿瘤再次运用累积效应模型分析，可以看到平均累积效应达12.5%，高于纳入所有样品时计算的9.5%；

- 随后通过BLUP（best linear unbiased predictor）计算累积模型中的关键基因，平均每个cohort可以找到所谓的weak drivers；

总结

目前所认识的passenger基因是有别于的driver基因的概念，但正如前期PCAWG分析结果，9%的肿瘤无已知的驱动基因；而肿瘤内大量所谓的passenger基因真的是如想象中毫无作用吗？只是一个搭顺风车的基因吗？答案已在文章阐述清楚！对每个基因突变进行功能影响评分后出现三峰现象，高/低影响的passenger基因对于肿瘤突变负荷、突变标签、克隆结构以及预后的影响，癌种之间高影响passenger基因突变类型的差异以及TFBSes上的passenger基因突变对于后续基因表达调控的影响，以上种种因素都说明一部分passenger基因并非都是neutral，可能起着weak negative/positive选择作用！

微信扫二维码转发分享